Структурная формула креатина.

Механизм, с помощью которого креатин улучшает спортивные результаты, не совсем ясен, хотя существует несколько теорий. Креатин, кажется, помогает спортсменам восстанавливаться после интенсивных упражнений. Организм использует креатин для производства фосфокреатина, который действует как буфер для поддержания производства аденозинтрифосфата (АТФ). АТФ — это топливо, используемое мышцами во время упражнений, а побочным продуктом является аденозиндифосфат (АДФ).Креатин, помимо прочего, существенно помогает регенерировать АДФ обратно в АТФ, пополняя запасы энергии в мышцах. Также может наблюдаться увеличение веса и мышечной массы при использовании креатина, до нескольких фунтов в неделю. Некоторая часть этого, вероятно, связана с задержкой воды.

Креатин в форме моногидрата или этилового эфира креатина (CEE) доступен в виде порошка для спортивных напитков или в форме капсул. Не существует общепринятых графиков дозирования или продолжительности, но многие спортсмены циклически используют креатин в течение трех месяцев, а затем месяц без креатина.Оптимальное время для приема креатина — сразу после тренировки в сочетании с напитком с высоким гликемическим индексом (например, фруктовым соком или коммерческим спортивным напитком).

Кратковременное употребление креатина считается безопасным, но может иметь потенциальные побочные эффекты. Наиболее частыми побочными эффектами являются вздутие живота, диарея и мышечные спазмы. Эти эффекты можно свести к минимуму, оставаясь хорошо гидратированным. Креатин не оказывает отрицательного воздействия на функцию почек, но не рекомендуется спортсменам с уже существующим заболеванием почек.Из-за отсутствия исследований среди детей, креатин не рекомендуется Американским колледжем спортивной медицины для спортсменов младше 18 лет.

Анализ функциональных свойств системы креатинкиназы с помощью многомасштабного «небрежного» моделирования

Abstract

В этом исследовании исследуется функция двух изоформ креатинкиназы (CK; EC 2.7.3.2) в миокарде. Гипотеза «фосфокреатинового челнока» утверждает, что митохондриальные и цитозольные ЦК играют ключевую роль в транспорте высокоэнергетических фосфатных групп (HEP) от митохондрий к миофибриллам сокращающихся мышц.Временная буферизация изменений АТФ и АДФ — еще одна потенциальная роль ЦК. С помощью математической модели мы проанализировали перенос энергии и затухание высоких пиков гидролиза АТФ во время сердечного цикла. Анализ был основан на многомасштабных данных, измеренных на уровне изолированных ферментов, изолированных митохондрий, и на динамическом времени реакции окислительного фосфорилирования, измеренном на уровне всего сердца. Используя «небрежное моделирование» ансамблевого моделирования, мы вывели доверительные интервалы для прогнозов вклада фосфокреатина (PCr) и АТФ в перенос HEP от митохондрий к участкам гидролиза АТФ.Наши расчеты показывают, что только 15 ± 8% (среднее ± стандартное отклонение) трансцитозольного переноса энергии переносится PCr, что противоречит гипотезе шаттла PCr. Мы также предсказали возможности временной буферизации изоформ СК, защищающих от высоких пиков гидролиза АТФ (3750 мкМ * с ^-1 ) в миофибриллах. Ингибирование ЦК на 98% in silico приводит к увеличению амплитуды пульсации митохондриального синтеза АТФ с 215 ± 23 до 566 ± 31 мкМ * с ^-1 , а амплитуды колебаний цитозольной концентрации АДФ удваиваются с 77 ± 11 до 146 ± 1 мкМ.Наши результаты показывают, что ЦК действует как буфер временной энергии с большой пропускной способностью и высокой емкостью, поддерживающий клеточный гомеостаз АТФ и снижающий колебания митохондриального метаболизма. Однако вклад ЦК в транспорт высокоэнергетических фосфатных групп кажется ограниченным. Активность митохондриальных ЦК снижает уровень цитозольных неорганических фосфатов, в то время как цитозольные ЦК имеют противоположный эффект.

Сведения об авторе

Креатинкиназа (КК) выполняет несколько функций в энергетическом метаболизме клеток.Он катализирует обратимый перенос высокоэнергетического фосфата от АТФ к креатину, способствуя накоплению энергии в форме фосфокреатина. В мышечных клетках этот дополнительный энергетический буфер играет ключевую роль в поддержании гомеостаза АТФ. Другой предполагаемой функцией ЦК является транспортировка энергии от производящих АТФ к участкам потребления АТФ посредством челночного механизма с участием митохондриальной и миофибриллярной изоформ ЦК. Степень, в которой этот механизм «фосфокреатинового челнока» используется в мышцах и других тканях, является предметом горячих споров.Мы используем вычислительную модель системы CK, которая может прогнозировать перенос энергии и буферизацию пиков высокого спроса, чтобы оценить относительную важность обеих ролей в сердечной мышце. Мы проверяем модель с помощью многомасштабных данных об уровне кинетических констант ферментов и с помощью измерений динамического потребления кислорода в сердцах кроликов. Поскольку на прогнозы модели могут сильно повлиять изменения значений параметров, мы используем «небрежное» ансамблевое моделирование, которое позволяет устанавливать доверительные области для прогнозов.Наши результаты показывают, что основная функция CK в сердечной мышце заключается больше во временной буферизации энергии высоких пиков потребления АТФ во время сердечного сокращения, чем в транспортировке энергии.

Образец цитирования: Hettling H, van Beek JH (2011) Анализ функциональных свойств системы креатинкиназы с помощью многомасштабного «небрежного» моделирования. PLoS Comput Biol 7 (8): e1002130. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130

Редактор: Кевин Скотт Браун, Калифорнийский университет в Санта-Барбаре, Соединенные Штаты Америки

Поступило: 24 августа 2010 г .; Принята к печати: 8 июня 2011 г .; Опубликовано: 11 августа 2011 г.

Авторские права: © 2011 Hettling, van Beek.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: HH было поддержано Центром системной биологии медицины, который является центром передового опыта в области геномики, финансируемым правительством Нидерландов через Нидерландскую инициативу по геномике (NGI). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Хорошо известно, что креатинкиназа (CK) катализирует обратимый перенос фосфата от АТФ к креатину (Cr) 🙁 1)

Однако то, как эта биохимическая функция играет роль в функционировании клеток, было предметом интенсивных споров [1]. Примечательно, что две различные изоформы CK экспрессируются в мышечных клетках: одна — во внутреннем мембранном пространстве митохондрий (IMS), а другая — в цитозоле, где расположены сократительные элементы.Это привело к идее «фосфокреатинового челнока», предложенной Бессманом и Гейгером [2]: образование PCr из аденинового нуклеотида и креатина в IMS катализируется митохондриальной изоформой CK, Mi-CK, расположенной в IMS. Затем PCr может перейти в цитозоль, что представляет собой механизм облегченной диффузии высокоэнергетических фосфатных (HEP) групп. Ретрансфер HEP к адениновому нуклеотиду для активации миофибриллярных сокращений осуществляется мышечной изоформой CK, MM-CK, расположенной в цитозоле (см. Рисунок 1).Утверждалось, что перенос HEP осуществляется либо путем прямой диффузии АТФ через внешнюю мембрану митохондрий (MOM) и цитозоль, либо косвенно через «фосфокреатиновый челнок». Гипотеза фосфокреатинового челнока привела к обширным научным дебатам о роли ЦК, например [1], [3], [4].

Рис. 1. Схема модели компартментализованной системы креатинкиназ.

Основными элементами являются гидролиз АТФ АТФазой, синтез АТФ митохондриями и изоформы креатинкиназы (СК) в митохондриальном межмембранном пространстве (Mi-CK) и цитозоле (MM-CK).Окислительное фосфорилирование (OxPhos) происходит в митохондриальном матриксе и реагирует на уровни АДФ и неорганического фосфата (P _i ) в митохондриальном межмембранном пространстве. Концентрации фосфокреатина (PCr), креатина (Cr), ADP, ATP и P _i зависят от скорости ферментативных реакций и транспорта. Рисунок был создан с помощью CellDesigner [57].

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.g001

Считалось, что система креатинкиназы, помимо функции передачи энергии, отвечает за (i) временную буферизацию энергии, поддерживая адекватное соотношение АТФ / АДФ во время прерывание подачи энергии [5] или во время изменения спроса на энергию [3], [6] и (ii) для регулирования окислительного фосфорилирования [7].Система ЦК, транспортирующая креатин вместо АДФ из цитозоля в митохондрии, является потенциальным ключевым регулятором окислительного фосфорилирования. Эксперименты по ингибированию CK на сердцах кроликов [8], [9] и эксперименты с нокаутом CK на мышах [10] предполагают, что система креатинкиназы влияет на динамическую адаптацию окислительного фосфорилирования к потребности в энергии.

Математическое моделирование оказалось полезным для понимания системы CK: несколько существующих моделей учитывают систему компартментализованного энергетического метаболизма в миоцитах в различных условиях [6], [11] — [16].Основные различия между анализируемой здесь моделью и другими моделями, описанными в литературе, рассматриваются в разделе «Обсуждение». Мы основываемся на ранее опубликованной вычислительной модели для динамической адаптации окислительного фосфорилирования к изменяющимся рабочим нагрузкам, которая захватывает ключевые элементы, ответственные за буферизацию и транспорт HEP между IMS и цитозолем [17], [18]. Модель включает синтез АТФ из АДФ путем окислительного фосфорилирования в митохондриях и потребление АТФ в цитозоле, обратимый перенос фосфатных групп от АТФ к креатину посредством ферментативных реакций CK и диффузию метаболитов между IMS и цитозолем через MOM (см. Рисунок 1). .На динамическое поведение модели влияют 22 свободных параметра кинетики ферментов и проницаемости мембран, которые были определены экспериментально и взяты из научной литературы.

В недавней работе мы исследовали чувствительность прогнозов этой модели CK в отношении возможной ошибки в параметрах с использованием упрощенного ансамблевого подхода и обнаружили, что даже небольшая ошибка по каждому параметру модели приводит к широкому диапазону возможных прогнозов [19] . Однако модели, содержащие множество молекулярно-кинетических параметров, все известные с небольшой точностью, могут давать полезные прогнозы, если учитывается корреляция этих неточностей.Brown et al. показали, используя вычислительную модель передачи сигналов фактора роста нервов, что предсказания жизнеспособных моделей могут быть достигнуты, несмотря на высокую степень неопределенности всех кинетических параметров [20], [21]. Подход выявляет так называемые «неаккуратные» комбинации параметров, которые при совместном изменении существенно не меняют результат моделирования модели, а это означает, что несколько комбинаций параметров одинаково хорошо описывают экспериментальные данные. Gutenkunst et al. исследовали множество метаболических и сигнальных сетей и обнаружили, что эти спектры чувствительности коррелированных параметров универсальны в моделях системной биологии [22].Чтобы использовать информацию из этих скрытых корреляций между параметрами, байесовский ансамбль различных наборов параметров, которые согласуются с экспериментальными данными, может быть взят с помощью методов Монте-Карло цепи Маркова (MCMC). Вероятность включения комбинации параметров в ансамбль пропорциональна вероятности того, что комбинация параметров предсказывает экспериментальный набор входных данных. Отправной точкой для обхода пространства параметров является набор параметров, полученный при подборе параметров методом наименьших квадратов к экспериментальным данным.Результирующий ансамбль наборов параметров, ограниченный экспериментальными данными, позволяет количественно оценить неопределенность не только значений параметров, но также очерчивать неопределенность прогнозов модели для новых экспериментальных вмешательств. Ниже мы демонстрируем, что объединение молекулярно-кинетических данных, данных органеллы и данных реакции всего органа с небрежным подходом к моделированию возможно и плодотворно.

Мы собрали набор предварительных данных о кинетических параметрах ферментов CK и использовали измерения окислительной способности и кинетики изолированных митохондрий и транспорта метаболитов через мембраны и цитозоль.Эти данные на молекулярном и органеллярном уровнях были объединены с экспериментальными данными о реакции всего сердца: для скачков на несколько уровней частоты сердечных сокращений измерялось время реакции увеличения потребления кислорода сердцем. Основываясь на модельном анализе кислородной транспортной системы, время реакции поглощения кислорода на уровне митохондрий может быть рассчитано на основе всего поглощения на уровне сердца [9]. Эти времена отклика для уровней CK дикого типа и во время ингибирования CK играли важную роль в качестве входных данных для анализа MCMC.Основываясь на этих данных с нескольких уровней в системе, мы прогнозируем вклад PCr в транспорт HEP и буферную способность системы по отношению к высокочастотным и высокоамплитудным пульсациям гидролиза ATP во время сердечного цикла. Как следствие, мы определили, что функциональная роль CK-системы в переносе энергии ограничена и что высокие импульсы при гидролизе АТФ буферизуются CK в масштабе времени порядка 100 миллисекунд; обе функции в настоящее время не доступны для экспериментального измерения.Неожиданно мы также обнаружили, что митохондриальная изоформа CK играет роль в регуляции уровня цитозольного неорганического фосфата.

Результаты

Мы использовали экспериментальные данные из трех шкал: параметры молекулярной кинетики, параметры емкости органелл и данные динамической реакции всего органа. Априорная экспериментальная информация о кинетических параметрах была извлечена из литературы (см. Таблицу 1). Для девяти из 22 параметров модели сообщалось о стандартных ошибках измерения.Чтобы ограничить эти параметры ошибками измерения, мы добавили эту молекулярную и органелларную информацию в качестве терминов к функции затрат по методу наименьших квадратов, которая также содержала динамическое время отклика, измеренное на уровне всего сердца (см. Методы). Таким образом, экспериментальные данные на молекулярном уровне, уровне органелл и всей системы обрабатываются единым образом. Для проницаемости MOM для адениновых нуклеотидов (PS _{mom, AdN} ), ключевого параметра, влияющего на транспортировку энергии и поведение буферизации системы, значения в литературе противоречивы [18].Поэтому параметр PS _{mom, AdN} не ограничивался. Функция стоимости определяет вероятность того, что набор параметров совместим с наблюдаемыми данными (см. Методы). Используя цепь Маркова Монте-Карло, выбирается распределение наборов параметров с высокой вероятностью совпадения с данными. Результирующий ансамбль наборов параметров, таким образом, представляет собой многомерное апостериорное распределение, сформированное функцией стоимости, которая отражает вероятность отдельных наборов параметров в байесовском смысле [21].

Данные о времени отклика на уровне всей системы были взяты из исследования Harrison et al., В котором перфузируемые сердца кроликов с электрическим кардиостимулятором подвергались ступенчатому увеличению частоты сердечных сокращений [9]. После применения испытания время метаболической задержки t _mito было рассчитано из динамических измерений потребления O ₂ для оценки обобщенной постоянной времени динамики выработки АТФ. С исходного уровня 135 ударов / мин (ударов в минуту) частота сердечных сокращений увеличилась до 160, 190 и 220 ударов в минуту соответственно.На сердца воздействовали либо йодуксусной кислотой (ИУК) для блокирования гликолиза, либо йодацетамидом (ИА) для ингибирования как гликолиза, так и активности ЦК, что дало в общей сложности 6 точек данных о времени реакции окислительного фосфорилирования, показанных на Рисунке 2. Детали модели, экспериментальные данные, функцию стоимости и подход к ансамблевому моделированию можно найти в разделе «Методы».

Рис. 2. Подгонка по модели измеренного времени отклика к шагам частоты пульса.

Время реакции окислительного фосфорилирования (t _mito ) измеряли в изолированных сердцах кроликов [9].Параметры модели оценивались с использованием модифицированного алгоритма Левенберга-Марквардта. Красные столбцы представляют значения t _mito из эксперимента, желтые столбцы представляют значения t _mito , предсказанные моделью после процедуры подбора. Доступны данные для шести различных состояний: три разных амплитуды скачка частоты сердечных сокращений (от 135 ударов в минуту до 160, 190 и 220 ударов в минуту), каждое из которых измеряется с полной активностью ЦК дикого типа (100%) или с активностью ЦК, подавленной до 2%. значения дикого типа.Столбики ошибок отражают стандартную ошибку измерений и стандартное отклонение значений t _mito в ансамбле, соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.g002

Оценка параметров

оценивались одновременно, чтобы соответствовать значениям t _mito для всех условий, с использованием процедуры оптимизации по методу наименьших квадратов. Различные алгоритмы оптимизации (симплексный алгоритм спуска, метод Пауэлла, Левенберга-Марквардта) дали одинаковое качество подгонки.Начальные и оптимизированные значения параметров можно найти в таблице 1. На рисунке 2 показаны все значения t _mito , предсказанные моделью до и после оптимизации параметров для всех условий. После подгонки модель правильно предсказывает более быструю передачу сигналов спроса и предложения энергии, когда CK ингибируется на 98%, вызывая более слабую буферизацию ADP / ATP с помощью CK. В процедуре оптимизации максимальные скорости ферментов Mi-CK и MM-CK были снижены на 12 и 36%, соответственно, от их исходных литературных значений.Эти литературные данные об активности ферментов для MM-CK и Mi-CK были взяты из той же экспериментальной модели, но без ингибирования гликолиза с помощью IAA [8]. Экспериментальные данные, использованные в настоящем анализе, были измерены в присутствии ИУК, которая, как было обнаружено, снижает активность ЦК на 20% [9]. Следовательно, снижение предполагаемой активности ЦК вполне вероятно. Другими параметрами, которые значительно изменяются при оптимизации, являются кажущаяся константа Михаэлиса для неорганического фосфата в митохондрии, K _pi , которая снижается с 800 до 347 мкМ, и кажущаяся константа K _M для ADP, K _adp , которая увеличивается с 25 до 36 мкМ.Оба параметра входят в уравнение модели, определяющее скорость окислительного фосфорилирования, что может объяснить обратное изменение. Существует in vitro измерений K _pi , которые ниже, чем исходное значение, используемое в этом анализе [18]: Stoner & Sirak, например, измерили K _pi как 360 мкМ [23], что близко к оптимизированному нами значению. стоимость. Аналогичным образом, заявленные значения для K _adp варьируются от 20 до 30 мкМ [24], [25], подтверждая значения, полученные при подборе.

Выборка наборов параметров методом Монте-Карло

Начиная с оптимизированного набора параметров (см. Таблицу 1), мы сделали выборку из пространства параметров, чтобы сгенерировать ансамбль из 658 независимых наборов параметров с использованием алгоритма Метрополиса-Гастингса. Набор параметров, обеспечивающий наименьшую стоимость во всем ансамбле, был этим оптимизированным набором параметров. Распределение всех параметров в ансамбле показано на рисунке 3. Девять кинетических параметров, для которых были известны значения погрешности (см. Таблицу 1), показывают среднее значение в ансамбле, близкое к измеренному значению, и стандартное отклонение, близкое к сообщенной ими ошибке измерения. из литературы, чего и следовало ожидать, учитывая априорную информацию в функции стоимости.Однако параметры, для которых не было стандартного значения ошибки, доступного в литературе в целом, дали стандартное отклонение в ансамбле, которое было меньше, чем присвоенная по умолчанию большая стандартная ошибка (см. Таблицу 1). Мы протестировали влияние различных допущений на априорные стандартные отклонения по умолчанию на апостериорные распределения параметров и ансамблевые прогнозы, представленные в тексте S1, который показывает, что приведенные здесь выводы не меняются на большие или меньшие значения по умолчанию.

Рисунок 3. Распределение отдельных параметров в ансамбле, созданном с помощью алгоритма Метрополиса-Гастингса.

На графиках показаны гистограммы всех значений в ансамбле для данного параметра. Ансамбль состоит из 658 наборов параметров. Красный график представляет собой функцию плотности вероятности логнормального распределения со средним значением и стандартным отклонением каждого параметра, масштабированными до наблюдаемых частот.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.g003

Среднее значение PS _{mom, AdN} в ансамбле составляет 31,7 с ⁻¹ , что больше оптимизированного значения 13,3 с ⁻¹ , найденного ранее [18]. Распределение PS _{mom, AdN} показывает существенный перекос с минимальным значением 7,4 с ^-1 и довольно резкое исключение малых значений, которые приводят к медленному времени отклика системы. На основании экспериментов с изолированными пермеабилизированными кардиомиоцитами Sepp et al. ([26]) оценили значение проницаемости МОМ для адениновых нуклеотидов, равное 1833 нмоль / мин / мг белка на мМ разности концентраций.Преобразование этого значения, выраженного на мг тканевого белка, при допущении, что 150 мг белка на грамм сырого веса, соответствует PS _{мама, AdN} = 7,45 ± 1,89 с ^-1 . Это практически то же самое, что и минимум, оцененный в нашем ансамблевом анализе.

Прогнозирование вклада PCr и ATP в перенос энергии

Вклад PCr во внутриклеточный перенос HEP, R _{diff, PCr} , количественно оценивается отношением диффузии PCr (J _{diff, PCr} ) к общей диффузии фосфатных групп через MOM: (2)

Ансамбль моделирования, основанный на ансамбле параметров, описанном выше, позволяет оценить доверительную область для прогнозирования модели.В ансамбле R _{diff, PCr} составляет в среднем 0,17 ± 0,09 (среднее ± стандартное отклонение) при ЧСС 160 уд / мин и 0,15 ± 0,08 при 220 уд / мин в случае активной КК. На рисунке 4 показан 95% доверительный интервал между верхней и нижней границей ансамблевого прогноза для R _{diff, PCr} для условий IAA и IA в устойчивом состоянии при частоте сердечных сокращений 220 ударов в минуту. Небольшие колебания во время ингибирования ЦК обусловлены 2% -ной остаточной активностью ЦК. Верхняя граница 95% доверительного интервала остается ниже 0,44 во время сердечного цикла для всех смоделированных условий.

Рисунок 4. Прогнозирование транспорта энергии от митохондрий к цитозолю с помощью PCr.

(A) Форсирующая функция пульсирующего цитозольного гидролиза АТФ для последних двух сердечных циклов моделирования более 60 с. (B) Прогноз относительного вклада PCr в поток высокоэнергетических фосфатов через внешнюю мембрану митохондрий (R _{diff, PCr} ) при частоте сердечных сокращений 220 ударов в минуту. Заштрихованная область дает центральный 95% доверительный интервал траекторий R _{diff, PCr} , полученных в результате ансамблевого моделирования 658 наборов параметров.Сплошные линии отображают одну симуляцию набора параметров с наилучшей оценкой. Синий цвет указывает на состояние с активным CK. Моделирование с CK, ингибируемым IA на 98%, нанесено оранжевым цветом. Обратите внимание, что два сердечных цикла нанесены на график после достижения устойчивого состояния.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.g004

R _{diff, PCr} уменьшается во время пиков гидролиза АТФ и даже становится отрицательным для самых низких траекторий в ансамбле, что указывает на обратную диффузию PCr. в митохондрии в конце систолы (рис. 4).Моделирование показывает для этих случаев, что АДФ диффундирует в IMS во время пиков гидролиза АТФ, стимулируя обращение митохондриальной реакции ЦК на производство АТФ из ПЦр, точно так же, как это происходит в цитозоле. Для этих самых низких траекторий в ансамбле активность CK на единицу объема межмембранного пространства выше, чем активность CK на единицу объема цитозоля, вызывая более резкое снижение PCr в межмембранном пространстве. Это приводит к тому, что концентрация цитозольного PCr превышает концентрацию PCr в IMS, а отрицательный градиент заставляет PCr диффундировать обратно в IMS.Однако при усреднении по сердечному циклу R _{diff, PCr} всегда положительный, что указывает на чистый поток PCr из митохондрий в цитозоль, и для подавляющего большинства диффузионного потока PCr ансамбля никогда не становится отрицательным в течение всего сердечного цикла. . Моделирование показало, что относительная важность PCr-челнока становится меньше при более высоком гидролизе АТФ при частоте сердечных сокращений 160, 190 и 220 ударов в минуту. Мы проверили эту гипотезу, предсказав R _{diff, PCr} для диапазона ЧСС от 60 до 300 ударов в минуту.Моделирование ансамбля показывает, что R _{diff, PCr} непрерывно падает с увеличением частоты сердечных сокращений для всех выбранных комбинаций параметров (см. Рисунок 5A). Прогнозируемое снижение R _{diff, PCr} и увеличение концентрации P _i согласуется с результатами недавнего исследования перфузированных сердец крыс [27]. Повышенная потребность в энергии вызывает повышенный градиент АТФ между обоими компартментами. При 160 bpm средняя разница между концентрацией АТФ в IMS и цитозоле составляет 18.6 мкмоль * л ^-1 , при 220 ударов в минуту становится 22,3 мкмоль * л ^-1 для оптимального набора параметров. Повышенный градиент АТФ через MOM индуцирует прямой транспорт АТФ вместо облегченного транспорта через PCr.

Рис. 5. Зависимость диффузионного потока PCr от частоты сердечных сокращений и проницаемости митохондриальной мембраны для адениновых нуклеотидов.

Прогнозирование вклада PCr в поток высокоэнергетического фосфата через внешнюю мембрану митохондрий (R _{diff, PCr} ), усредненное по сердечному циклу, как функция (A) частоты сердечных сокращений и (B) проницаемости внешней мембраны митохондрий для нуклеотидов аденина (PS _{мама, AdN} ) соответственно.Значения для (A) значений устойчивого состояния для R _{diff, PCr} в зависимости от частоты пульса (B) Значения устойчивого состояния для R _{diff, PCr} в зависимости от PS _{мамы, AdN} при фиксированной частоте пульса 220 уд / мин. Мы выполнили моделирование для ансамбля, показанного на рисунке 3, с частотой сердечных сокращений или PS _{мама, AdN} , установленными в соответствии с осью x. Области, заштрихованные синим цветом, отображают 95% доверительный интервал прогноза, черные сплошные линии показывают прогноз для оптимизированных параметров (см. Таблицу 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.g005

Чтобы продемонстрировать зависимость использования челнока от проводимости мембраны для адениновых нуклеотидов, мы предсказали R _{diff, PCr} как функцию PS _{. мама, АДН} для ансамбля. Прогнозируемый диапазон, показанный на рисунке 5B, показывает, что только при очень небольшой проницаемости для АТФ вклад PCr становится высоким. Даже за минимальную стоимость ПС _{мама, АдН} в ансамбле (7.35 с ⁻¹ ), весь 95% доверительный интервал R _{diff, PCr} остается ниже 0,5. Низкая проницаемость MOM для адениновых нуклеотидов вызывает транспорт высокоэнергетических фосфатных групп через PCr, и то, что PS _{mom, AdN} никогда не ниже 7,35 s ^-1 , следовательно, свидетельствует против преобладающего транспорта фосфокреатина. Также, когда значение PS _{м / м, AdN} = 7,45 с ^-1 по оценкам Sepp et al. ([26]), см. Выше, включено как предварительное знание, анализ по-прежнему дает аналогичные прогнозы R _{diff, PCr} , которые остаются с доверительной вероятностью 95% между 0.16 и 0,46 при ЧСС 220 уд / мин.

Можно утверждать, что значение K _ia митохондриальных ЦК должно быть установлено равным 290 мкМ при активном окислительном фосфорилировании ([28]), чтобы отразить функциональное связывание ЦК с транслокатором адениновых нуклеотидов (ANT). Оптимизация, основанная на этом значении K _ia , дает в результате, что в среднем 18% потока высокоэнергетического фосфата при частоте сердечных сокращений 220 ударов в минуту транспортируется в форме PCr, а остальное — в виде АТФ. Значения параметров для V _{max, Mi, f} , рассчитанные для митохондрий сердца крысы, составляют 1609 ± 113 мкМ / с в [28] и V _{max, ATPsyn} составляет 2960 мкМ / с, что примерно вдвое превышает значение, измеренное у кролика. исследование сердца проанализировано здесь.При использовании параметров сердца крысы в ​​сочетании с K _ia = 290 мкМ, вклад PCr в транспорт высокоэнергетических фосфатов оценивается в 25%. Дальнейший анализ модели, которая включает микрокомпартмент, который функционально связывает митохондриальную креатинкиназу с транслокатором аденин-нуклеотида ([6]), показывает, что трудно объяснить время ответа и молекулярно-кинетические параметры одновременно с этой моделью. Результаты этого анализа можно найти в тексте S2.Вывод о том, что вклад PCr в транспорт высокоэнергетических фосфатов относительно невелик, кажется надежным, поскольку в ансамблевом исследовании с параметрами сердца кролика этот вклад оценивался в 15-17%, см. Выше, и не становится существенно выше. в анализах с другими наборами параметров.

Прогнозирование временной буферизации энергии

Описанные выше результаты показывают, что прямой транспорт АТФ преобладает в работающей сердечной мышце. Учитывая, что переключение энергии PCr имеет ограниченное значение, мы исследовали еще одну потенциальную функцию CK, т.е.е. временная буферизация энергии. Когда потребление АТФ миофибриллами превышает продукцию митохондриального АТФ во время сокращения мышц, гомеостаз АТФ может поддерживаться с помощью PCr [4]. Ансамблевые прогнозы для R _{diff, PCr} , концентраций цитозольного АДФ и P _i и скорости синтеза АТФ при относительной активности CK 2, 100 и 300% от уровней дикого типа показаны на рисунке 6. Обратите внимание, что Mi-CK и MM-CK-активности изменяются одним и тем же фактором в этом наборе моделирования. Даже при 3-кратном увеличении активности CK, R _{diff, PCr} не увеличивается резко (Рисунок 6F).Однако на колебания концентрации цитозольного АДФ в значительной степени влияет активность ЦК. Амплитуда колебаний ADP составляет 77 ± 11 мкМ при нормальных уровнях CK и становится 146 ± 1 мкМ, если CK ингибируется на 98%, как в случае перфузированных сердец, обработанных IA (фигура 6K, J). При трехкратном увеличении активности CK она становится 36 ± 22 мкМ (рис. 6L). При моделировании гипотетического случая с увеличением активности фермента в 10000 раз колебания концентраций адениновых нуклеотидов почти полностью затухают до амплитуды 2.6 ± 0,2 мкМ (данные не показаны).

Рис. 6. Колебания концентраций и потоков метаболитов во время сердечного цикла на трех уровнях активности ЦК.

Графики показывают (A – C) траекторию форсирующей функции гидролиза АТФ и ансамблевые прогнозы (D – F) R _{diff, PCr} , (G – I) скорость синтеза митохондриального АТФ, (J – L) цитозольный ADP и (M – O) цитозольные концентрации P _i при частоте сердечных сокращений 220 ударов в минуту. Активности Mi-CK и MM-CK были установлены на 2, 100 и 300% уровней дикого типа.Три сердечных цикла показаны в устойчивом состоянии. Сплошные линии показывают смоделированную траекторию оптимизированного набора параметров (см. Таблицу 1). Заштрихованные области показывают 95% доверительный интервал для всех траекторий ансамбля из 658 наборов параметров. Чтобы изменить активность CK, параметры, описывающие максимальную скорость фермента, V _{max, Mif} и V _{max, MMf} , изменяются параллельно с указанным процентом.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.g006

Динамика выработки митохондриального АТФ колеблется с амплитудами 566 ± 31, 215 ± 23 и 91 ± 14 мкМ * с ⁻¹ для 2 , 100 и 300% относительной активности ЦК, соответственно (Рисунок 6G – I).Пульсация концентраций АТФ и АДФ и синтеза АТФ синхронизирована с гидролизом АТФ в миофибриллах. Области уверенности для этих траекторий относительно узкие. Блокируя CK на 98%, средняя концентрация АДФ в IMS увеличивается до 64 ± 9 мкМ с 56 ± 9 мкМ при нормальном уровне CK. В отличие от АДФ, амплитуда колебаний цитозольного неорганического фосфата остается относительно постоянной при различных активностях ЦК на уровне около 145 мкМ. Это отражает то, что P _i не буферизируется напрямую CK.Удивительно, но средний уровень цитозольного неорганического фосфата падает с активностью ЦК. Средняя концентрация P _i при 2% активности ЦК составляет 1618 ± 97 мкМ и становится 1416 ± 80 мкМ для активности ЦК дикого типа (Фиг.6M, N). Для всех наборов параметров в ансамбле концентрация P _i снижается при увеличении активности CK.

Специфическая роль митохондриальной изоформы CK

Транспорт HEP с помощью PCr из митохондрий в цитозоль частично происходит через цепь, образованную обеими изоформами CK, но, как было предсказано, количественно это не очень важно.С другой стороны, для временной буферизации всплеска систолического гидролиза АТФ требуется только активность MM-CK в цитозоле, которая намного выше, чем активность Mi-CK (см. Таблицу 1). Поэтому до сих пор неясно, какова функция митохондриальной изоформы CK.

Для дальнейшего выяснения влияния компартментализованной системы ЦК на метаболизм мы выполнили ансамблевые прогнозы с индивидуальным ингибированием обеих изоформ ЦК одну за другой. На рисунке 7 мы показываем 95% доверительные интервалы прогнозируемых концентраций метаболитов и потоков реакции.Прогнозируется, что амплитуда колебаний в синтезе митохондриального АТФ вырастет с 215 ± 23 мкМ * с ^-1 при исходной активности ЦК до 278 ± 33 при 98% ингибировании Mi-CK, по сравнению с 375 ± 21 мкМ при использовании MM-CK. ингибируется на 98% (Рисунок 7I – K). Таким образом, несмотря на свою низкую активность, Mi-CK все же оказывает небольшое, но явное влияние на амплитуду колебаний синтеза АТФ. Ингибирование Mi-CK имеет больший эффект, когда MM-CK уже ингибирован (амплитуда 565 ± 31 мкМ * с ^-1 , фигура 7L). На подавление колебаний АДФ сильно влияет MM-CK, но не Mi-CK: 98% ингибирование Mi-CK приводит к увеличению амплитуды систолических колебаний ADP с 77 ± 11 до 83 ± 11 мкМ (рис. 7M, N), тогда как ингибирование MM-CK удваивает амплитуду до 146 ± 1 мкМ (фиг. 70).

Рис. 7. Ансамблевые прогнозы концентраций метаболитов и колебаний потока во время сердечного цикла для селективного ингибирования изоформ CK.

В первом ряду (панели A – D) нанесена функция импульсного форсирования для гидролиза АТФ. Прогнозы временных изменений (E – H) относительного вклада PCr в транспорт высокоэнергетических фосфатов, R _{diff, PCr} , (I – L) скорости синтеза АТФ, (M – P) цитозольного ADP и (Q – T ) P _и концентраций. Пульс 220 уд / мин.В четырех столбцах мы сравниваем: отсутствие ингибирования CK, 98% ингибирование Mi-CK, 98% MM-CK или обе ферментативные реакции CK ингибированы на 98%. Черные сплошные линии показывают смоделированную траекторию оптимизированного набора параметров (Таблица 1). Области, заштрихованные синим цветом, показывают центральный доверительный интервал 95% для всех траекторий ансамбля из 658 наборов параметров. Чтобы изменить активность CK, параметры, описывающие максимальную скорость фермента, V _{max, Mif} и V _{max, MMf} , изменяются на указанный процент.После достижения устойчивого состояния показаны три сердечных цикла. Обратите внимание, что первый и последний столбцы также появляются на рисунке 6 и показаны здесь для удобства сравнения.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.g007

Прогнозы R _{diff, PCr} показывают, что и Mi-CK, и MM-CK необходимы для функционирования фосфокреатинового шаттла. Диффузия PCr, усредненная по сердечному циклу, вносит очень небольшой вклад в общий HEP, доставленный из митохондрий, когда Mi-CK или MM-CK ингибируется на 98%.С 98% ингибированной активностью Mi-CK, R _{diff, PCr} даже немного ниже нуля во время диастолы с низким гидролизом АТФ, что означает, что PCr транспортируется из цитозоля в IMS (рис. 7F). Обратите внимание, что эта ситуация обратная по отношению к нормальной активности Mi-CK и MM-CK, где диффузия PCr всегда положительна во время диастолы и иногда становится отрицательной во время пиков гидролиза АТФ. Для нормальной активности CK объяснение обратной диффузии PCr во время гидролиза АТФ (рис. 7E) заключалось в том, что активность CK на единицу объема выше в IMS, чем в цитозоле.Во время ингибирования Mi-CK это, конечно, уже не так, и систолическое потребление PCr в цитозоле приводит к диффузии PCr из IMS, объясняя обращение транспорта PCr во время систолы. Напротив, при ингибировании MM-CK АТФ буферизуется Mi-CK в IMS, и PCr диффундирует в IMS в конце пиков гидролиза АТФ. Это объясняет, почему R _{diff, PCr} становится более отрицательным во время пиков гидролиза АТФ с ингибированием MM-CK, и его колебания сильнее, чем для нормальной активности Mi-CK и MM-CK (рис. 7E, G).При ингибировании активности Mi-CK наша модель предсказывает увеличение амплитуды колебаний [ADP] в IMS с 57 ± 8 до 71 ± 8 мкМ. Таким образом, Mi-CK оказывает демпфирующее действие на колебания концентраций АДФ в IMS, что способствует подавлению синтеза митохондриального АТФ.

Предполагается, что концентрация цитозольного P _i будет снижена за счет активности митохондриальной креатинкиназы. Блокирование Mi-CK приводит к увеличению P _i примерно на 18% с 1416 ± 80 до 1670 ± 167 мкМ (рис. 7Q, R).Если Mi-CK ингибируется на 100%, концентрация P _i в устойчивом состоянии становится равной 1678 ± 173 мкМ (данные не показаны). Ингибирование MM-CK снижает концентрацию P _i ; комбинация ингибирования Mi-CK и MM-CK приводит к несколько более высокому уровню P _i по сравнению с диким типом (фиг. 7S, T).

Discussion

Относительная важность различных ролей системы CK в миоцитах все еще горячо обсуждается [4]. Настоящее исследование было разработано для изучения функции ЦК в кардиомиоцитах при различных нагрузках.В частности, мы стремились выяснить, является ли фосфокреатиновый челнок основным путем передачи HEP от митохондрий к потребляющим энергию миофибриллам, как указано в гипотезе фосфокреатинового челнока, или же CK имеет другие метаболические функции, например демпфирование колебаний концентраций АТФ и АДФ и окислительного фосфорилирования.

Были опубликованы различные компьютерные исследования метаболизма сердечной энергии, основанные на моделях, содержащих реакцию креатинкиназы, гидролиз и синтез АТФ.Модель, анализируемая в настоящем исследовании, является подмножеством модели Vendelin et al. ([6]) и был описан ранее [17], [18]. Диффузионные градиенты в цитозоле, которые, как было показано, были очень малы ([6]), были заменены простой диффузионной проводимостью. Транслокатор адениновых нуклеотидов и переносчик фосфата во внутренней мембране митохондрий и реакции окислительного фосфорилирования (OxPhos) в митохондриях в модели Vendelin et al. были заменены уравнением Михаэлиса-Ментен, описывающим поток OxPhos как функцию ADP и Pi в межмембранном пространстве [18].Модель была дополнительно модифицирована для предотвращения термодинамически невозможных петель путем введения ограничений на равновесие реакций ЦК в IMS и цитозоле [19]. Некоторые модели в литературе реализуют субстратный канал между ANT и Mi-CK с помощью микрокомпартмента, который расположен внутри межмембранного пространства [6], [11], [29]. Характеристики этих моделей обсуждаются ниже. Существуют и другие модели энергетического метаболизма миокарда, которые не учитывают роль двух изоформ креатинкиназы, связанных посредством облегченной диффузии.Например, Beard et al. интегрировали подробную модель окислительного фосфорилирования [14] с моделью пространственно распределенного транспорта кислорода и метаболизма HEP для исследования регуляции окислительного фосфорилирования при различных сердечных нагрузках [5] и буферизации HEP в сердце при высоких нагрузках, острой ишемии и реактивном гиперемированном восстановлении. .

В настоящем исследовании мы предсказали функции изоформ фермента CK на основе следующей стратегии. Был собран набор экспериментальных данных из нескольких шкал.Мы основывали анализ на нашей модели, которая, как было показано, содержит ключевые элементы системы CK [17], [18]. Набор экспериментальных данных позволил оценить все параметры этой модели. Чтобы установить доверительные интервалы для предсказаний функции CK, экспериментальные ошибки для данных были явно учтены. Это стало возможным благодаря созданию ансамбля наборов параметров модели. Вероятность того, что набор параметров является частью ансамбля, определялась на основе вероятности предсказанного набора экспериментальных данных при заданных параметрах.Такой подход получил название неаккуратного моделирования [21]. Brown et al. [20] и Gutenkunst et al. [22] применили его к временным рядам уровней активности белка, измеренных во время динамических реакций системы в целом. Удивительным открытием в их исследованиях было то, что отклики системы в целом были предсказуемы с приемлемыми доверительными интервалами, даже если все параметры модели были известны с очень плохой точностью. Это возможно, потому что корреляция между параметрами хорошо определяется поведением системы в целом.

Новым аспектом в настоящем исследовании является то, что мы объединили данные, полученные с разных уровней интеграции в системе: кинетические параметры, определенные для отдельных ферментов, уровни активности ферментов, измеренные в гомогенатах тканей, уровни органелл, измеренные на изолированных митохондриях, и определенное время динамического ответа. на сердце в целом. Время реакции всего органа было очень важно, потому что оно чувствительно зависит от проницаемости адениновых нуклеотидов через внешнюю митохондриальную мембрану, одного из параметров органеллярного уровня.Эту проницаемость MOM невозможно определить экспериментально с какой-либо степенью точности в изолированных митохондриях. Объединение некоторых стратегически важных данных на уровне всей системы с молекулярными параметрами оказывается достаточным для прогнозирования свойств системы с приемлемыми доверительными областями (рисунки 4-7).

Многие из экспериментов, которые призваны поддерживать высокую степень функциональной связи между CK и ANT, были выполнены в изолированных митохондриях или в изолированных миоцитах и ​​мышечных волокнах, которые были проницаемы.Их часто изучали при температурах существенно ниже физиологического уровня. Важным аспектом нашего анализа является то, что мы пытаемся оценить функциональную роль ЦК в неповрежденном сердце. С этой целью мы объединяем кинетические данные на молекулярном уровне с данными, полученными на изолированных перфузированных сердцах. Важно понимать, что эти сердца были неповрежденными, с полностью функциональной сократительной способностью и клеточными мембранами. Наш модельный анализ объясняет экспериментальные данные без привлечения прямого взаимодействия CK и ANT.Однако ограниченная проницаемость внешней мембраны митохондрий для адениновых нуклеотидов, оцениваемая по времени отклика в интактном сердце, приводит к определенной степени динамической компартментации адениновых нуклеотидов. Такой подход помогает определить функциональную роль ЦК в интактном сердце при физиологических температурах. Если прямое связывание CK-ANT является единственным способом доставки ADP в ANT, то эксперименты с 98% ингибированием CK не могут быть объяснены. Тогда также было бы трудно объяснить, что животные с нокаутом Mi-CK все еще обладают значительной сократительной функцией сердца [30].Будущие модели взаимодействия CK-ANT должны учитывать такие экспериментальные наборы данных с ингибированием CK, а также объяснять данные по фосфатному мечению Erickson-Viitanen et al. [31]

Наши результаты показывают, что основная роль системы ЦК в сердечной мышце — служить временным энергетическим буфером для АТФ и АДФ в масштабе времени 100 миллисекунд. Роль СК в поддержке транспорта высокоэнергетических фосфатных групп кажется ограниченным. Если подача кислорода прерывается, PCr также буферизует АТФ и АДФ в течение нескольких секунд [5].Таким образом, временная буферизация энергии имеет относительно большую полосу пропускания. Жубер и др. экспериментально исследовали роль CK-шаттла с помощью протоколов передачи намагниченности ³¹ P ЯМР in vivo и предложили гипотезу о разносторонней роли PCr во внутриклеточном переносе энергии в зависимости от сердечной деятельности [32], [33]. Частичное ингибирование синтеза АТФ привело к снижению непрямого транспорта энергии через PCr. Это снижение предсказывается нашей моделью (данные не показаны). Некоторые вычислительные модели разделения энергии в мышцах, как, например, у Vendelin et al.([13]) предполагают ограниченную диффузию аденозиновых нуклеотидов до такой степени, что перенос энергии через PCr становится существенным. Однако большое ограничение проникновения адениновых нуклеотидов в цитозоль и MOM несовместимо с относительно быстрыми ответами окислительного фосфорилирования на этапы цитозольной рабочей нагрузки [18].

Параметр проводимости PS _{mom, AdN} в нашей модели отражает не только проникновение собственно MOM, но и диффузию в миофибриллах и цитозоле.Обратный PS _{mom, AdN} в нашей модели, следовательно, является суммой обратных продуктов проницаемости-поверхности (PS) для собственно MOM и цитозоля, соответственно [18]. Настоящий ансамблевой подход Монте-Карло показывает, что PS _{mom, AdN} находится в диапазоне от 7,4 до 115 с ⁻¹ (см. Рисунок 3). На основании коэффициента поперечной диффузии 52 мкм ² / с для АТФ в миофибриллярном пространстве, измеренного с помощью флуоресцентно меченого АТФ [34], рассчитанный PS для цитозоля равен 216.7 секунд ^-1 [18]. Учитывая совокупное среднее значение PS _{м / м, AdN} 31,7 с ^-1 (см. Таблицу 1), мы прогнозируем, что около 15% общего сопротивления диффузии может быть отнесено к цитозолю. Обратите внимание, что флуоресцентно меченый АТФ имеет более высокую молекулярную массу, чем АТФ. Истинный коэффициент диффузии АТФ, вероятно, выше, и поэтому вклад цитозольного пространства в диффузионное сопротивление, вероятно, переоценен в этом расчете. Вклад PCr в транспорт HEP, предсказанный в настоящем исследовании (рисунок 4), совместим с измеренным временем отклика системы (рисунок 2).Было высказано предположение, что в кардиомиоцитах плотность митохондрий и их близость к миофибриллам достаточны для обеспечения транспорта энергии через аденозиновые нуклеотиды [3]. Предсказание нашей модели о том, что транспорт PCr с помощью CK не является обязательным для транспорта HEP, согласуется с наблюдением, что нокаут CK имеет относительно слабые эффекты на сердечную функцию [10], [30], [35].

Было высказано предположение, что активация окислительного фосфорилирования сильно зависит от субстратного канала АТФ и АДФ между тесно связанными ферментами Mi-CK и ANT, что означает, что АТФ, экспортированный из митохондриального матрикса через ANT, сразу становится доступным в качестве субстрата для Mi-CK. .Полученный АДФ затем направляется обратно, чтобы стимулировать окислительное фосфорилирование в митохондриальном матриксе. Однако гипотеза функционального сцепления все еще обсуждается [1], а другие исследования, кажется, противоречат ей [36]. Чтобы исследовать эффект функциональной связи между ANT и Mi-CK, мы реализовали и проанализировали модель Vendelin et al. ([6]), где реакции связаны микрокамерой (см. Текст S2). Считается, что модель, которая содержит константы, феноменологически отражающие функциональную связь Mi-CK с ANT, дает хорошее и эффективное в вычислительном отношении представление функциональной связи между Mi-CK и окислительным фосфорилированием [29].Подобрать модель Vendelin et al. к приведенным экспериментальным данным времени задержки митохондрий (t _mito ) при учете измерений молекулярно-кинетических параметров в функции стоимости. Эта модель не могла предсказать более быструю реакцию на скачок скорости потребления АТФ после ингибирования CK, особенно при низких рабочих нагрузках. Даже когда все параметры из модели Vendelin et al. были переменными во время процедуры оптимизации, качество подгонки далеко от оптимального, несмотря на то, что модель Vendelin et al.имеет примерно в три раза больше параметров, чем наша нынешняя модель. Поэтому мы не рассматриваем микрокомпартмент в нашем настоящем исследовании.

Настоящие результаты предполагают, что большая часть задержки активации окислительного фосфорилирования после временных изменений гидролиза АТФ вызвана задержкой изменений уровней фосфатных метаболитов за пределами внутренней митохондриальной мембраны. Чтобы выяснить, задерживают ли процессы внутри митохондрий ответ дальше, мы протестировали модель митохондриального матрикса, включая транспорт метаболитов через внутреннюю митохондриальную мембрану с мгновенными ступенчатыми изменениями АДФ или Р _и , а также АДФ и Р _и одновременно снаружи. внутренняя митохондриальная мембрана.Это соответствует модели, примененной в тексте S2, когда все процессы вне внутренней митохондриальной мембраны удалены, а концентрации АДФ и P _– вне внутренней митохондриальной мембраны установлены как вынуждающая функция. После 20% увеличения концентрации АДФ синтез АТФ в митохондриях достиг стабильно более высокого уровня в течение одной секунды. Время отклика, рассчитанное как для t _mito , составило 0,4 с. Для шага в P _i отклик был еще быстрее с отрицательным значением для времени отклика -0.3 с, потому что ответ показал перерегулирование. При одновременном изменении АДФ и P _i митохондриальный ответ был практически полным в течение полсекунды, а время ответа — 0,08 с. Когда внемитохондриальный АДФ изменяется, как потребление кислорода митохондриями, так и отток АТФ через АНТ реагируют даже быстрее, чем реакция АТФ-синтазы. Быстрый ответ митохондриального метаболизма, предсказанный моделью, согласуется со спектроскопическими измерениями степени окисления цитохрома b-переносчика электронов, который окислялся с полупериодом 70 миллисекунд после ступени внемитохондриальной концентрации АДФ при 26 ° C, и предположительно намного быстрее при физиологической температуре [37].

В исследованиях изолированных митохондрий сердечной мышцы кролика прямой вклад митохондриального АТФ в образование PCr с помощью Mi-CK невелик [31]. Для радиоактивно меченных фосфатных групп было показано, что если концентрация АТФ в среде митохондрий превышает 0,2 мМ, менее 6% синтеза ПЦР использует АТФ, синтезированный непосредственно заранее в митохондриальном матриксе. Это несовместимо с моделью, в которой основная часть PCr синтезируется из АТФ, непосредственно переданного креатинкиназе через очень маленький отсек с ограниченным обменом с окружающей средой.

С помощью анализа in silico мы вывели различные роли митохондриальных и миофибриллярных ферментов креатинкиназы. MM-CK в основном отвечает за демпфирование больших колебаний концентраций метаболитов и больших колебаний скорости окислительного фосфорилирования, которые в противном случае были бы вызваны большими пиками гидролиза АТФ во время сердечного цикла. Mi-CK ограничивает высокие концентрации неорганического фосфата, что удивительно, учитывая, что неорганический фосфат не обрабатывается напрямую CK.Несмотря на свою низкую активность, Mi-CK также снижает колебания синтеза АТФ, в основном за счет влияния Mi-CK на колебания ADP в межмембранном пространстве.

Влияние изоформ СК на буферизацию колебаний АДФ и предотвращение высоких концентраций неорганического фосфата может играть роль в предотвращении образования активных форм кислорода (АФК). Производство АФК сильно зависит от потенциала митохондриальной мембраны, который увеличивается при низких уровнях АДФ [38], [39].Электрический мембранный потенциал в митохондриях также может быть изменен неорганическим фосфатом, что приводит к усиленному высвобождению АФК [40]. Согласно нашим прогнозам, низкие концентрации АДФ во время диастолы предотвращаются с помощью MM-CK (см. Рисунок 7). Наша модель также предсказывает защитную роль Mi-CK против образования кислородных радикалов, предотвращая высокие концентрации неорганического фосфата. Функция Mi-CK по предотвращению образования кислородных радикалов была экспериментально обнаружена в изолированных митохондриях мозга [38].Энергетическая буферная роль системы ЦК связана с предотвращением окислительного стресса в нейронах [41], [42]. Креатиновые добавки к питанию также показали нейропротекторный эффект на моделях болезни Хантингтона [43], [44]. Влияние креатина в качестве пищевой добавки на здоровье и болезни недавно было изучено Wallimann et al. [45].

В заключение мы показали, что с помощью относительно небольшой модели «скелета» мы смогли объяснить динамическую адаптацию сердечного энергетического метаболизма к изменяющимся рабочим нагрузкам и различить различные функции отдельных изоферментов CK.Небрежный подход к моделированию позволяет делать полезные прогнозы поведения системы ЦК, несмотря на ограниченные экспериментальные исходные данные и ограниченные знания кинетических параметров. Концепция небрежного моделирования также может быть использована для поиска оптимальных экспериментальных планов для дальнейшего тестирования модели [46]. Мы также продемонстрировали, что сочетание анализа компьютерной модели с экспериментальными данными об уровне клеточных органелл и изолированных ферментов и с реакцией сердца в целом обеспечивает мощную комбинацию, которая дает ценную информацию о функциональных функциях ЦК, таких как регуляция окислительное фосфорилирование, перенос энергии, уровни неорганического фосфата и буферизация пиков гидролиза АТФ в масштабе времени 100 миллисекунд.

Методы

Расчетная модель

Для нашего анализа мы использовали ранее опубликованную вычислительную модель [18]. Он доступен в различных форматах и ​​может быть найден в базе данных BioModels [47], а также в репозитории моделей CellML [48]. Модель включает ключевые элементы системы ЦК с синтезом АТФ в митохондриях и пульсирующим гидролизом АТФ в цитозоле (см. Рисунок 1). Вход модели — форсирующая функция цитозольного использования АТФ, катализируемая миозин-АТФазой и ионными насосами.Модель содержит десять обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ), описывающих скорость изменения концентрации каждого метаболита (АДФ, АТФ, PCr, Cr, P _и ) в двух частях с течением времени. Эти уравнения подробно описаны ранее [18]. Динамика модели зависит от 22 кинетических параметров, извлеченных из литературы, которые перечислены в таблице 1. В целом кинетические константы, извлеченные из литературы, имеют относительно скромные стандартные ошибки. Однако для проницаемости МОМ для АТФ и АДФ (предполагается, что при модельном анализе они равны; см.[6]), зарегистрированные значения различались от 0,16 [6] до 85 мкм * с ^-1 в модели Берда [14] на основе измерений Lee et al. [49]. Это большое отклонение, возможно, связано с процедурами выделения митохондрий или проницаемости клеточной мембраны.

Параметр продукта проницаемость внешней мембраны — поверхность митохондрий PS _{mom, AdN} сильно влияет на время реакции для динамической адаптации окислительного фосфорилирования. Таким образом, динамические измерения венозного оттока кислорода в сердце в целом в ответ на увеличение частоты сердечных сокращений позволяют оценить проницаемость митохондриальной мембраны на уровне органелл.Измерения всего сердца были скорректированы на задержку транспорта кислорода, чтобы отразить события на уровне митохондрий (см. Ниже). Время митохондриального ответа t _mito определяется как обобщенная постоянная времени зависимости от времени потребления кислорода (определяемая как эквивалент первого центрального статистического момента функции импульсного отклика в случае, если система является линейной), ранее описанная в [18], [50] — [52]. Из моделирования модели t _mito рассчитывается следующим образом: (3)

Где J _{ATPhyd, базовый} и J _{ATPhyd, test} — это значения скоростей гидролиза АТФ для двух значений частоты сердечных сокращений с электрическим ритмом на исходном уровне и уровне теста, усредненные по сердечному циклу; J _ATPsyn обозначает динамику синтеза АТФ в митохондрии.t _шаг — момент времени, когда частота сердечных сокращений увеличивается, а t _end — момент времени последнего измерения кислорода. Обратите внимание, что среднее значение J _ATPsyn в установившемся состоянии до и в конце тестовой нагрузки равно J _{ATPhyd, базис} и J _{ATPhyd, тест} , соответственно.

Чтобы соответствовать экспериментальным условиям в [9], t _end был установлен на 60 секунд с t _step = 0 секунд; начальный пробег в течение 40 секунд перед шагом измерения пульса гарантирует, что синтез АТФ адаптировался к гидролизу АТФ и находится в устойчивом состоянии на этой стадии.Чтобы исследовать демпфирующие способности смоделированной системы, гидролиз АТФ моделируется как пульсирующая функция, представляющая переменный характер потребности в энергии в систолу и диастолу, как описано в [18]. На рисунке 8 показан динамический ответ выработки митохондриального АТФ в ответ на увеличение частоты сердечных сокращений и гидролиз АТФ.

Рис. 8. Пульсирующий характер производства и потребления энергии в бьющемся сердце и реакция на скачок частоты сердечных сокращений.

Показаны временные характеристики (A) гидролиза АТФ и (B) синтеза, смоделированные с помощью модели на Рисунке 1.В момент времени 0 с средняя скорость гидролиза АТФ увеличивалась с 486,5 до 627,6 мкМ * с ^-1 , что соответствовало увеличению частоты сердечных сокращений со 135 до 220 ударов в минуту, как это было наложено в экспериментах, которые были смоделированы в этом исследовании. Обратите внимание на разницу в масштабе оси Y между панелями A и B.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.g008

Небрежное моделирование ансамбля

Почти все модели в системной биологии содержат параметры, которые нельзя точно определить.Обычной практикой является оценка недостающих значений параметров с помощью параметра, соответствующего экспериментальным данным. После подбора можно делать прогнозы модели и анализировать лежащие в основе биологические процессы. Это, однако, опасно, потому что ряд комбинаций параметров может одинаково хорошо согласовываться с имеющимися данными, что может привести к отклонениям от модельных прогнозов новых экспериментальных ситуаций. Направления в пространстве параметров, где изменения параметров действительно очень мало меняют результат моделирования, были названы Брауном и др. «Небрежными»., тогда как направления, в которых небольшие изменения значений параметров сильно влияют на динамическое поведение системы, были названы «жесткими» [21]. Спектры чувствительности с неаккуратным параметром были идентифицированы для множества биологических моделей путем анализа собственных векторов и собственных значений матрицы чувствительности, рассчитанной на основе функции стоимости хи-квадрат [22]. Неаккуратные модели демонстрируют характерный паттерн с логарифмами собственных значений, приблизительно равномерно распределенными в большом диапазоне. Анализ чувствительности модели CK выявил наличие как жестких, так и неаккуратных комбинаций параметров и «неаккуратного» спектра чувствительности [53].Поскольку наша модель демонстрирует неаккуратную чувствительность параметров и основана на данных, подверженных экспериментальным вариациям, получение прогнозов на основе ансамбля наборов параметров предпочтительнее, чем просто полагаться на один набор параметров, соответствующий экспериментальным данным. Согласно парадигме небрежного моделирования ([21], [22]), вероятность того, что набор параметров модели будет включен в ансамбль, пропорциональна его вероятности описать данные экспериментальные данные, умноженной на вероятность предшествующей экспериментальной информации о сами значения параметров.Таким образом, процесс выборки основан на байесовском выводе апостериорного распределения наборов параметров, где — вероятность данных для данного набора параметров, — это априорная вероятность набора параметров, основанная на экспериментальных априорных знаниях о значениях одного параметра, а апостериорная вероятность — вероятность набора параметров для описания заданных экспериментальных данных. Построение ансамбля методом Монте-Карло цепей Маркова (MCMC) было выполнено с помощью алгоритма Метрополиса-Гастингса [54].Программная среда Sloppy Cell, использованная для анализа, была адаптирована для обработки всех операторов, которые были в файле SBML, описывающем модель. Модифицированная версия представлена ​​в наборе данных S1. Чтобы ускорить сходимость, Sloppy Cell делает большие шаги по неаккуратным направлениям и меньшие шаги по жестким направлениям в пространстве параметров; эта «выборка по важности» описана в [20], [21].

Экспериментальные данные

Измеренные значения параметров молекулярной модели и их происхождение, извлеченные из научной литературы, перечислены в таблице 1.Для девяти из 22 параметров можно было найти надежные стандартные ошибки измерения. В дополнение к прямым измерениям молекулярных параметров мы используем значения t _mito из исследования Harrison et al. где были исследованы эффекты ингибирования креатинкиназы и различных размеров скачков частоты сердечных сокращений с электрическим ритмом в сердцах кроликов [9]. Изолированные сердца перфузировали раствором Тирода, содержащим, среди прочего, глюкозу и пируват, чтобы обеспечить субстрат для энергетического метаболизма.В наш набор данных мы включаем два экспериментальных условия, в которых сердца подвергались воздействию либо (i) йодауксусной кислоты (IAA) для блокирования глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), либо (ii) йодацетамида (IA) для ингибирования как CK, так и GAPDH. Чтобы обеспечить достаточное количество восстанавливающих эквивалентов для подпитки аэробного дыхания, несмотря на ингибирование гликолиза, буфер также содержал пируват.

Аденозин был добавлен в буфер Тироде, чтобы обеспечить неограниченное поступление кислорода при регистрации потребления кислорода.Измерения всего сердца были скорректированы на время переноса O ₂ в коронарных сосудах на основе модели переноса кислорода за счет конвекции в кровеносных сосудах и диффузии через ткань. Таким образом, t _mito отражает время ответа на уровне митохондрий (см. [9] и цитируемые там ссылки). Среднее время отклика было также скорректировано с учетом небольшого отклонения от идеальной стадии гидролиза АТФ от биения к биению, измеренного как начальное превышение произведения скорость-давление [50].Для каждого условия были установлены шаги частоты сердечных сокращений от 135 до 160, 190 и 220 ударов в минуту, соответственно, с использованием электрической стимуляции. Обратите внимание, что гликолиз всегда неактивен, когда измеряется динамический отклик, что соответствует отсутствию гликолиза в вычислительной модели. Этот подход позволил отделить вклад системы ЦК от вклада гликолиза, что устраняет значительную сложность анализа модели.

Стадия гидролиза АТФ из 486.От 5 до 627,6 мкмоль * л ^-1 клеточная вода * с ^-1 соответствует шагу в частоте сердечных сокращений с электрическим кардиостимулятором от 135 до 220 ударов в минуту, как было оценено на основе измерений потребления кислорода миокардом [18]. Из этих значений мы линейно интерполировали скорости гидролиза 531,4 и 579,5 мкмоль * л ^-1 клеток воды * с ^-1 для ЧСС 160 и 190 ударов в минуту, соответственно. Для моделирования ингибирования ЦК с помощью ИА параметры модели для максимальных скоростей обеих ферментативных реакций были установлены на 2.3% от их исходных значений, что соответствует активности CK, измеренной для подавленных сердец. Обратите внимание, что активность ферментов, емкость митохондрий и время динамической реакции всего органа были измерены в одной и той же экспериментальной модели в одной лаборатории.

Функция затрат

Параметры модели подбираются к экспериментальным данным с использованием модифицированной процедуры наименьших квадратов Левенберга-Марквардта в пространстве логарифмических параметров, которая является частью среды моделирования SloppyCell.Для нашей модели и данных мы рассчитываем стоимость для данного набора параметров следующим образом: (4) где y _c является прогнозом модели t _mito (уравнение 3) как функция значения параметра θ и d _c — измеренное значение для условия c со стандартной ошибкой. Первый член функции стоимости учитывает экспериментальные данные на уровне всего сердца, тогда как второй член представляет предшествующую экспериментальную информацию о значениях параметров, найденных в литературе или измеренных в сочетании с смоделированными экспериментами.Априорная стоимость, которая дает штраф для параметра θ _i за отклонение от его измеренного значения θ _i ^* , рассчитывается как в [54] 🙁 5)

Обратите внимание, как априор используется для ввода экспериментально измеренной информации о параметрах, измеренных на молекулярном уровне, во втором члене уравнения. 4, в то время как первый член вносит измеренную информацию обо всем отклике системы. Отклонения прогнозируемого времени отклика от измеренных значений штрафуются по сравнению со стандартными ошибками измерения, а отклонение молекулярных параметров от измеренных значений штрафуется по сравнению со стандартными ошибками, о которых сообщается.Значения молекулярных параметров, приведенные в литературе, обычно представлены как среднее значение и стандартная ошибка. Однако в рамках небрежного моделирования предпочтительно выбирать нормальное распределение в логическом пространстве [20], [22], [54]. Гауссово распределение логарифмических параметров было предложено как биологически правдоподобное [55]. Это удобный способ работать с безразмерными положительными величинами как значениями параметров [56].

Для того, чтобы вычислить значение σ для параметра θ в пространстве журналов из его сообщенной стандартной ошибки (с учетом диапазона 95% доверительной области), мы устанавливаем значение следующим образом: (6) где SE — абсолютная стандартная ошибка параметр θ _i .Если стандартная ошибка мала по сравнению со средним значением параметра, формы предыдущих распределений становятся приблизительно нормальными (см. Рисунок 3). Поскольку стандартные ошибки можно было найти только для девяти из всех 22 параметров системы, мы выбрали значение по умолчанию для остальных параметров, которое должно быть максимальным из всех значений для параметров с известной ошибкой. Этот максимум был ошибкой параметра бинарной константы диссоциации креатина из Mi-CK (K _{ib, Mi} и см. Таблицу 1).Чтобы исследовать влияние измененного предварительного стандартного отклонения по умолчанию на апостериорные распределения параметров и ансамблевые прогнозы, мы выполнили несколько дополнительных ансамблевых симуляций с более низкими и высокими значениями по умолчанию. Результаты этого моделирования можно найти в тексте S1. Параметр, описывающий проводимость MOM для адениновых нуклеотидов, PS _{mom, AdN} , не мог быть надежно определен экспериментами на органеллярном уровне и, следовательно, не ограничивался предшествующими исследованиями.

Определение неопределенности прогноза: ансамблевое моделирование

Первая оценка значений параметров была определена методом наименьших квадратов для данных с использованием функции стоимости уравнения 4.Эта начальная оценка наилучшего параметра, полученная в результате оптимизации, используется в качестве отправной точки для обхода пространства параметров с использованием алгоритма Метрополиса-Гастингса. Запуск случайного блуждания из оптимизированного набора параметров позволил алгоритму быстрее сходиться к апостериорному распределению. Мы используем реализацию алгоритма в SloppyCell для выборки наборов параметров с плотностью вероятности, пропорциональной. Все скрипты для воспроизведения представленных расчетов можно найти в Dataset S2.Чтобы гарантировать, что члены ансамбля статистически независимы, мы «сокращаем» ансамбль, беря только каждые n ^-й выборок, где n — максимальное время корреляции всех параметров. Время корреляции параметра определяется как постоянная времени его автокорреляционной функции. Для нашей модели 50000 шагов в случайном блуждании достаточно для получения более 600 независимых наборов параметров. Независимые наборы параметров в ансамбле обеспечивают окончательную оценку параметров, характеризуемую не только средним значением, но и стандартным отклонением, которое отражает разброс оценки.Расчеты выполнялись параллельно на параллельной машине ClusterVision с 16 узлами, состоящими из четырех процессоров с тактовой частотой 3 ГГц и 4 ГБ ОЗУ. Из соображений вычислительной производительности мы рассчитали моделирование для оценки параметров и ансамблевой выборки с усредненной скоростью гидролиза АТФ по сердечному циклу, а не с пульсирующим паттерном, показанным на рисунке 8. Это значительно сократило время, необходимое для расчетов, что сделало возможным выполнение ансамблевые расчеты за несколько часов.

Однако, чтобы исследовать демпфирующие характеристики системы, мы используем импульсную форсирующую функцию гидролиза АТФ (см. Рисунок 8A) [18].Для оценки различий в уровнях и потоках метаболитов, вызванных заменой пульсирующей функции на усредненную по времени непрерывную функцию, из всех наборов параметров, опробованных в ходе случайного блуждания Монте-Карло, случайным образом были взяты 1000 наборов параметров, чтобы сравнить значения результатов модели между пульсирующие и непульсирующие симуляции. Переменные, наиболее подверженные влиянию пульсационного приближения, — это R _{diff, PCr} и t _mito . Разница между импульсным и непульсирующим моделированием всех 1000 наборов параметров составляет 7.6 ± 4,3 и 6,8 ± 1,5% (среднее ± стандартное отклонение) соответственно. Значения t _mito из непульсирующего моделирования всегда немного меньше значений из импульсного моделирования, но их отклонение меньше, чем стандартная ошибка экспериментальных данных t _mito . Разница между результатами пульсирующей и непульсирующей модели для других переменных составляет менее 4,5% от их средних значений в непульсирующей настройке.

Дополнительная информация

Набор данных S1.

Исправленная библиотека Python SloppyCell. Этот дополнительный набор данных состоит из исправленной версии библиотеки SloppyCell Python версии 0.8.1, которая требуется для воспроизведения всех вычислений в этой рукописи. Пакет предоставляется в виде zip-файла. Подробные инструкции по установке можно найти в zip-файле.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.s001

(ZIP)

Текст S1.

Ансамблевые предсказания с различными априорными стандартными отклонениями по умолчанию. Этот дополнительный текст сообщает о результатах нашей процедуры анализа, когда предполагаются меньшие или большие стандартные стандартные отклонения по умолчанию для параметров с неизвестной стандартной ошибкой.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002130.s003

(PDF)

Текст S2.

Анализ модели с дополнительным микрокаметом, который связывает CK с транслокатором адениновых нуклеотидов. В этом дополнительном тексте мы представляем результаты анализа вычислительной модели, которая реализует субстратный канал между Mi-CK и ANT в микрокомпартменте, интегрированные с данными о времени ответа митохондрий, используемыми в этом исследовании.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1002130.s004

(PDF)

Благодарности

Мы очень благодарны Райану Гутенкунсту за отличный совет по использованию среды моделирования SloppyCell и Бернду Брандту за научный совет и помощь с компьютерным кластером. Мы также благодарим Яапа Херинга за предложения и комментарии к рукописи.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: HH JHGMvB. Проведены эксперименты: HH. Проанализированы данные: HH JHGMvB.Написал статью: HH JHGMvB.

Ссылки

1. 1. Борода Д.А., Кушмерик М.Дж. (2009) Сильный вывод для системной биологии. PLoS Comput Biol. 5. e1000459 с. Доступно: http: //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi? Artid = 2724742 & tool = pmcentrez & rendertype = abstract.
2. 2. Бессман С.П., Гейгер П.Дж. (1981) Транспорт энергии в мышцах: фосфорилкреатиновый челнок. Наука. 211.: 448–452. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6450446.
3. 3. Мейер Р.А., Суини Х.Л., Кушмерик М.Дж. (1984) Простой анализ «фосфокреатинового шаттла». Am J Physiol 246: C365 – C377.
4. 4. Greenhaff PL (2001) Креатин-фосфокреатиновая система: в ее репертуаре более одной песни. J Physiol. 537. 657 с. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=11744744.
5. 5. Beard DA (2006) Моделирование транспорта кислорода и клеточной энергетики объясняет наблюдения за метаболизмом сердечной энергии in vivo.PLoS Comput Biol. 2. e107 с. Доступно: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pcbi.0020107.
6. 6. Vendelin M, Kongas O, Saks V (2000) Регулирование митохондриального дыхания в клетках сердца, проанализированное с помощью реакционно-диффузионной модели передачи энергии. Am J Physiol Cell Physiol. 278.: C747–764. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=10751324.
7. 7. Сакс В.А., Вентура-Клапир Р., Алиев М.К. (1996) Метаболический контроль и метаболическая емкость: два аспекта функционирования креатинкиназы в клетках.Biochim Biophys Acta 1274: 81–88.
8. 8. Harrison GJ, Wijhe MH van, Groot B de, Dijk FJ, Beek JH van (1999) Ингибирование СК ускоряет передачу сигналов трансцитозольной энергии во время быстрых шагов рабочей нагрузки в изолированных сердцах кроликов. Am J Physiol 276: h234 – h240.
9. 9. Харрисон Г.Дж., Ван Вейхе М.Х., Грут Б. де, Дейк Ф.Дж., Густафсон Л.А. и др. (2003) Гликолитическая буферизация влияет на сердечную биоэнергетическую сигнализацию и сократительный резерв подобно креатинкиназе. Am J Physiol Heart Circ Physiol.285. Есть в наличии. стр. H883 – H890. В наличии: 10.1152 / ajpheart.00725.2002.
10. 10. Gustafson LA, Van Beek JH (2002) Время активации окислительного фосфорилирования миокарда у мышей с нокаутом креатинкиназы и аденилаткиназы. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282.: h3259–2264. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=12003836.
11. 11. Алиев М.К., Сакс В.А. (1997) Компартментарный перенос энергии в кардиомиоцитах: использование математического моделирования для анализа регуляции дыхания in vivo.Biophys J. 73.: 428–445. В наличии: 10.1016 / S0006-3495 (97) 78082-2.
12. 12. Сакс В.А., Конгас О., Венделин М., Кей Л. (2000) Роль системы креатин / фосфокреатин в регуляции митохондриального дыхания. Acta Physiol Scand 168: 635–641.
13. 13. Венделин М., Эймре М., Сеппет Э., Пит Н., Андриенко Т. и др. (2004) Внутриклеточная диффузия аденозинфосфатов локально ограничена в сердечной мышце. Mol Cell Biochem. 256-257. : 229–241. Доступно: http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=14977184.
14. 14. Бирд Д.А. (2005) Биофизическая модель митохондриальной респираторной системы и окислительного фосфорилирования. PLoS Comput Biol. 1. e36 p. Доступно: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1201326&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
15. 15. Wu F, Zhang EY, Zhang J, Bache RJ, Beard DA (2008) Концентрации фосфатных метаболитов и потенциал гидролиза АТФ в нормальном и ишемическом сердце.J Physiol. 586.: 4193–4208. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=18617566.
16. 16. Wu F, Beard DA (2009) Роль системы креатинкиназы и миоглобина в поддержании энергетического состояния в работающем сердце. BMC Syst Biol. 3. 22 п. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=1
    04.
17. 17. Kongas O, Beek JH van (2007) Креатинкиназа в передаче сигналов энергетического метаболизма в мышцах.Предшествующая природа. Доступно: http://precedings.nature.com/documents/1317/version/1.
18. 18. Beek JHGM van (2007) Адениннуклеотид-креатин-фосфатный модуль в метаболической системе миокарда объясняет быструю фазу динамической регуляции окислительного фосфорилирования. Am J Physiol Cell Physiol. 293.: C815 – C829. В наличии: 10.1152 / ajpcell.00355.2006.
19. 19. Beek JHGM van, Hauschild A-C, Hettling H, Binsl TW (2009) Надежное моделирование, измерение и анализ метаболических систем человека и животных.Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 367.: 1971–1992. В наличии: 10.1098 / rsta.2008.0305.
20. 20. Браун К.С., Хилл С.К., Калеро Г.А., Майерс С.Р., Ли К.Х. и др. (2004) Статистическая механика сложных сигнальных сетей: передача сигналов фактора роста нервов. Phys Biol. 1.: 184–195. В наличии: 10.1088 / 1478-3967 / 1/3/006.
21. 21. Браун К.С., Сетна Дж. П. (2003) Статистические механические подходы к моделям со многими малоизвестными параметрами. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys 68: 21904.
22. 22. Gutenkunst RN, Waterfall JJ, Casey FP, Brown KS, Myers CR и др. (2007) Универсальная неаккуратная чувствительность параметров в моделях системной биологии. PLoS Comput Biol. 3.: 1871–1878. В наличии: 10.1371 / journal.pcbi.0030189.
23. 23. Stoner CD, Sirak HD (1979) Установившаяся кинетика общей реакции окислительного фосфорилирования в митохондриях сердца. J Bioenerg Biomembr 11: 113–146.
24. 24. Heineman FW, Balaban RS (1990) Анализ ядерного магнитного резонанса Phosphorus-31 временных изменений метаболизма миокарда собак in vivo.J Clin Invest. 85.: 843–852. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=2312728.
25. 25. Jacobus W, Moreadith R, Vandegaer K (1982) Митохондриальный респираторный контроль. Доказательства против регуляции дыхания с помощью потенциалов внемитохондриального фосфорилирования или соотношений [АТФ] / [АДФ]. J Biol Chem. 257.: 2397–2402. Доступно: http://www.jbc.org/cgi/content/abstract/257/5/2397.
26. 26. Sepp M, Vendelin M, Vija H, Birkedal R (2010) Анализ компартмента ADP показывает связь между пируваткиназой и АТФазами в сердечной мышце.Biophys J. 98.: 2785–2793. Доступно: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2884246&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
27. 27. Vendelin M, Hoerter JA, Mateo P, Soboll S, Gillet B и др. (2010) Модуляция путей передачи энергии между митохондриями и миофибриллами путем изменения производительности перфузируемого сердца. J Biol Chem. 285.: 37240–37250. Доступно: http://www.jbc.org/cgi/content/abstract/285/48/37240.
28. 28. Jacobus WE, Saks VA (1982) Креатинкиназа митохондрий сердца: изменения ее кинетических свойств, вызванные взаимодействием с окислительным фосфорилированием.Arch Biochem Biophys 219: 167–178.
29. 29. Венделин М., Лемба М., Сакс В.А. (2004) Анализ функционального сцепления: митохондриальная креатинкиназа и транслоказа аденин-нуклеотидов. Biophys J. 87.: 696–713. Доступно: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1304393&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
30. 30. Saupe KW, Spindler M, Tian R, Ingwall JS (1998) Нарушение сердечной энергетики у мышей, лишенных специфичных для мышц изоферментов креатинкиназы.Circ Res. 82.: 898–907. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9576109.
31. 31. Erickson-Viitanen S, Viitanen P, Geiger PJ, Yang WC, Bessman SP (1982) Компартмент митохондриальной креатинфосфокиназы. I. Прямая демонстрация компартментации с использованием меченых прекурсоров. J Biol Chem. 257.: 14395–14404. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7142217.
32. 32. Жубер Ф., Матео П., Жилле Б., Белойл Дж. К., Мазет Дж. Л. и др. (2004) Поток СК или прямой перенос АТФ: универсальность путей передачи энергии, подтвержденная ЯМР в перфузируемом сердце.Mol Cell Biochem 256-257: 43-58.
33. 33. Joubert F, Mazet J-L, Mateo P, Hoerter JA (2002) ЯМР 31P обнаружение потоков субклеточной креатинкиназы в перфузируемом сердце крысы: сократимость изменяет пути передачи энергии. J Biol Chem. 277.: 18469–18476. В наличии: 10.1074 / jbc.M2007.
34. 34. Vendelin M, Birkedal R (2008) Анизотропная диффузия флуоресцентно меченого АТФ в кардиомиоцитах крысы, определяемая с помощью корреляционной спектроскопии растровых изображений.Am J Physiol Cell Physiol. 295.: C1302–1315. Доступно: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2584976&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
35. 35. Векслер В.И., Кузнецов А.В., Анфлоус К., Матео П., Дерсен Джван и др. (1995) Мышцы с дефицитом креатинкиназы. II. Сердечные и скелетные мышцы демонстрируют тканеспецифичную адаптацию митохондриальной функции. J Biol Chem. 270. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7650007.
36. 36.Липская Т.Ю., Савченко М.С. (2003) Еще раз о функциональном сопряжении митохондриальной креатинкиназы и адениннуклеотидтранслоказы. Биохимия (Москва). 68.: 68–79. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12693979.
37. 37. Chance B (1965) Энергетическая реакция кальция с митохондриями. J Biol Chem. 240.: 2729–2748. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14304892.
38. 38. Meyer LE, Machado LB, Santiago AP, da-Silva WS, De Felice FG и др.(2006) Активность митохондриальной креатинкиназы предотвращает генерацию активных форм кислорода: антиоксидантная роль митохондриальной киназы-зависимой активности рециклинга АДФ. J Biol Chem. 281.: 37361–37371. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=17028195.
39. 39. Коршунов С.С., Скулачев В.П., Старков А.А. (1997) Высокий протонный потенциал запускает механизм производства активных форм кислорода в митохондриях.FEBS Lett. 416.: 15–18. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9369223.
40. 40. Oliveira GA, Kowaltowski AJ (2004) Фосфат увеличивает высвобождение активных форм кислорода в митохондриях. Free Radic Res. 38.: 1113–1118. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15512800.
41. 41. Klivenyi P, Ferrante RJ, Matthews RT, Bogdanov MB, Klein AM, et al. (1999) Нейропротективные эффекты креатина на трансгенной животной модели бокового амиотрофического склероза.Nat Med. 5.: 347–350. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10086395.
42. 42. Брюер Г.Дж., Валлиманн Т.В. (2000) Защитный эффект креатина-предшественника энергии против токсичности глутамата и бета-амилоида в нейронах гиппокампа крысы. J Neurochem. 74.: 1968–1678. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10800940.
43. 43. Херш С.М., Геворкян С., Мардер К., Московиц С., Фейгин А. и др. (2006) Креатин при болезни Хантингтона безопасен, переносится, биодоступен в головном мозге и снижает содержание в сыворотке крови 8Oh3’dG.Неврология. 66.: 250–252. Доступно: http://www.neurology.org/cgi/content/abstract/66/2/250.
44. 44. Мэтьюз Р.Т., Ян Л., Дженкинс Б.Г., Ферранте Р.Дж., Розен Б.Р. и др. (1998) Нейропротекторные эффекты креатина и циклокреатина на животных моделях болезни Хантингтона. J Neurosci. 18.: 156–163. Доступно: http://www.jneurosci.org/cgi/content/abstract/18/1/156.
45. 45. Wallimann T, Tokarska-Schlattner M, Schlattner U (2011) Система креатинкиназы и плейотропные эффекты креатина.Аминокислоты. 40.: 1271–96. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21448658.
46. 46. Кейси Ф. П., Бэрд Д., Фенг К., Гутенкунст Р. Н., Водопад Дж. Дж. И др. (2007) Оптимальный экспериментальный план в модели передачи сигналов и подавления рецепторов эпидермального фактора роста. ИЭПП Сист Биол. 1.: 190–202. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=175.
47. 47. Ле Новер Н., Борнштейн Б., Бройхер А., Курто М., Донизелли М. и др.(2006) База данных BioModels: бесплатная централизованная база данных тщательно отобранных, опубликованных количественных кинетических моделей биохимических и клеточных систем. Nucleic Acids Res. 34.: D689–691. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16381960.
48. 48. Ллойд С.М., Лоусон-младший, Хантер П.Дж., Нильсен П.Ф. (2008) Репозиторий моделей CellML. Биоинформатика. 24.: 2122–2123. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? cmd = Получить & db = PubMed & dopt = Citation & list_uids = 18658182.
49. 49. Ли А.С., Зизи М., Коломбини М. (1994) Бета-НАДН снижает проницаемость внешней мембраны митохондрий для АДФ в 6 раз. J Biol Chem. 269.: 30974–30980. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=7983033.
50. 50. Beek JH van, Westerhof N (1990) Время отклика митохондриального потребления кислорода после ступенчатых изменений потребности сердца в энергии.Adv Exp Med Biol 277: 415–423.
51. 51. Бик Дж. Х. Ван, Тиан Х, Зурбьер С. Джей, Грут Б. де, Эхтельд С. Джей ван и др. (1998) Динамическое регулирование окислительного фосфорилирования миокарда: анализ времени реакции потребления кислорода. Mol Cell Biochem 184: 321–344.
52. 52. Beek JH van, Westerhof N (1991) Время отклика потребления кислорода сердечными митохондриями на шаги частоты сердечных сокращений. Am J Physiol 260: H613 – H625.
53. 53. Beek J van, Hettling H, Binsl T (2008) Вычислительные методы для исследования и управления молекулярными сетями в клетках.В: Backendorf C, Noteborn MH, Tavassoli M, редакторы. Белки убивают опухолевые клетки. Указатель исследований. 317 с.
54. 54. Gutenkunst RN, Atlas JC, Casey FP, Kuczenski RS, Waterfall JJ, et al. (2007) SloppyCell. См. Http://sloppycell.sourceforge.net/.
55. 55. Schaber J, Liebermeister W, Klipp E (2009) Вложенные неопределенности в биохимических моделях. ИЭПП Сист Биол. 3.: 1–9. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=180.
56. 56. Либермейстер В., Клипп Э. (2005) Биохимические сети с неопределенными параметрами. Syst Biol (Стивенэйдж). 152.: 97–107. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16986274.
57. 57. Funahashi A, Morohashi M, Kitano H, Tanimura N het (2003) CellDesigner: редактор диаграмм процессов для генно-регуляторных и биохимических сетей. Biosilico. 1.: 159–162. Доступен: 10.1016 / S1478-5382 (03) 02370-9.
58. 58. Teague WE Jr, Dobson GP (1992) Влияние температуры на равновесие креатинкиназы. J Biol Chem. 267.: 14084–14093. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=1629208.
59. 59. Сакс В. А., Черноусова Г. Б., Веттер Р., Смирнов В. Н., Чазов Е. И. (1976) Кинетические свойства и функциональная роль частиц ММ-изофермента креатинфосфокиназы, связанного с миофибриллами сердечной мышцы.FEBS Lett 62: 293–296.
60. 60. Groot B de (1999) Роль митохондрий и внутриклеточной передачи энергии в патогенезе сердечной недостаточности. Кандидатская диссертация, Университет VU Амстердам, Амстердам: Университет VU, Амстердам.

Антивозрастные свойства креатина