Шарлотта Бодри

¹ Inserm, U913, Institut Fédératif de Recherche Франция

9269 2, Международная федерация исследований и исследований Université de Nantes, Faculté de Médecine, Нант, Франция

³ CHU Nantes, Hôtel Dieu, Institut des Maladies de l’Appareil Digestif, Нант, Франция

François Human Reichardt

^{, Freising-Weihenstephan, Germany}

Justine Marchix

¹ Inserm, U913, Institut Fédératif de Recherche Thérapeutique, IFR26 Nantes, France

² Université de Nantes, Facultine de Nantes, Facultine de Nantes s, France

³ CHU Nantes, Hôtel Dieu, Institut des Maladies de l’Appareil Digestif, Nantes, France

André Bado

⁵ Inserm, U773, Centre de Recherche Biomédicale Bichat 7 — Дени Дидро, IFR02 Клод Бернар, Париж, Франция

Михаэль Шеманн

⁴ Lehrstuhl für Humanbiologie, Technische Universität München, Freising-Weihenstephan, Германия

, Станислас Брюли,

, Станислас,

, Станислас Брюли,

Fédératif de Recherche Thérapeutique, IFR26 Nantes, France

² Université de Nantes, Faculté de Médecine, Nantes, France

³ CHU Nantes, Hôtel Dieu, Institut des Maladies de l’Apc. Мишель Нойнлист

¹ Inserm, U913, Institut Fédératif de Recherche Thérapeutique, IFR26 Нант, Франция

² Université de Na ntes, Faculté de Médecine, Nantes, France

³ CHU Nantes, Hôtel Dieu, Institut des Maladies de l’Appareil Digestif, Нант, Франция

Raphaël Moriez

¹ Inserrait, U , IFR26 Nantes, France

² Université de Nantes, Faculté de Médecine, Nantes, France

³ CHU Nantes, Hôtel Dieu, Institut des Maladies de l’Appareil Digestifser, Nantes, France

, U913, Institut Fédératif de Recherche Thérapeutique, IFR26 Nantes, France

² Université de Nantes, Faculté de Médecine, Nantes, France

³ CHU Nantes, Hôtel des lédés de l’Isdie de Digites , Франция

⁴ Lehrstuhl für Humanbiologie, Technische Universität München, Freising-Weihenstephan, Germany

⁵ Inserm, U773, Centre de Recherche Biomédicale Bich в Божоне, UFR de Médecine Paris 7 — Denis Diderot, IFR02 Claude Bernard, Paris, France

WAT: белая жировая ткань; OGTT: пероральный тест на толерантность к глюкозе; AUC глюкозы: площадь под кривой ответа на глюкозу.Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, критерий Манна – Уитни.

Поступила 31 августа 2011 г .; Принято 23 ноября 2011 г.

Copyright © 2012 Авторы. The Journal of Physiology © The Physiological Society Эта статья цитируется другими статьями в PMC.

Abstract

Нетехническое резюме

Кишечная нервная система (ENS) — это автономная нервная система, интегрированная вдоль кишечника, которая контролирует основные функции желудочно-кишечного тракта (GI), такие как моторика.Все больше данных продемонстрировали, что факторы питания могут модулировать фенотип ENS и, следовательно, влиять на функции желудочно-кишечного тракта. Западная диета играет центральную роль в развитии ожирения, но, к удивлению, ни одно исследование не охарактеризовало ее влияние на фенотип и функции ENS. Мы показываем, что ожирение, вызванное западной диетой (DIO), предотвратило возрастную потерю в определенной популяции кишечных нейронов, что привело к ускорению опорожнения желудка. Кроме того, мы показали, что нейропротекторные эффекты DIO, вероятно, связаны с лептином и нейротрофическим фактором линии глиальных клеток (GDNF).Это первое исследование, демонстрирующее влияние DIO на ENS. Эти вызванные DIO нейропластические изменения в ENS могут быть вовлечены в физиопатологию ожирения.

Abstract

Факторы питания могут вызывать глубокие нейропластические изменения в кишечной нервной системе (ENS), ответственные за изменения моторики желудочно-кишечного тракта (GI). Однако долгосрочные эффекты дисбаланса питания, приводящего к ожирению, такие как западная диета (WD), на фенотип ENS и контроль моторики желудочно-кишечного тракта остаются неизвестными.Поэтому мы исследовали влияние ожирения, индуцированного WD (DIO), на фенотип и функцию ENS, а также факторы, участвующие в функциональной пластичности. Мышей кормили нормальной диетой (ND) или WD в течение 12 недель. Подвижность ЖКТ оценивали in vivo и ex vivo . Нейроны кишечника и глии анализировали иммуногистохимическими методами с использованием антител против Hu, нейрональной синтазы оксида азота (nNOS), Sox-10 и методами визуализации кальция. Лептин и нейротрофический фактор, производный от линии глиальных клеток (GDNF), изучали с использованием иммуногистохимических, биохимических методов или методов ПЦР на мышах и первичной культуре ENS.DIO предотвращал связанное с возрастом уменьшение антральных нитрергических нейронов, наблюдаемое у мышей ND. Стимуляция нервов вызвала более сильный ответ нейронов Ca ²⁺ у WD по сравнению с мышами ND. DIO индуцировал NO-зависимое увеличение опорожнения желудка и нервно-мышечной передачи в антральном отделе без каких-либо изменений транзита через тонкий кишечник. Во время WD, но не ND, в антральном отделе происходило зависящее от времени увеличение лептина и GDNF. Наконец, мы показали, что лептин увеличивает продукцию GDNF в ENS и индуцирует нейропротекторные эффекты, частично опосредованные GDNF.Эти результаты демонстрируют, что DIO вызывает нейропластические изменения в антральном отделе, ведущие к NO-зависимому ускорению опорожнения желудка. Кроме того, индуцированная DIO нейропластичность в ENS, вероятно, связана с лептином и GDNF.

Введение

Кишечная нервная система (ENS) играет центральную роль в контроле функций желудочно-кишечного тракта (GI) как при здоровье, так и при заболеваниях. В то время как нейроны подслизистой оболочки являются основными регуляторами функций слизистой оболочки, нейроны кишечника участвуют в контроле подвижности желудочно-кишечного тракта (Kunze & Furness, 1999)).Кишечный контур, ответственный за перистальтику, характеризуется поляризованной иннервацией с участием восходящих возбуждающих нейронов и нисходящих тормозных нейронов. Возбуждающие нейроны являются холинергическими и часто совместно локализуют вещество P, в то время как тормозные нейроны синтезируют нейрональный оксид азота (nNOS), а также вазоактивный кишечный пептид или АТФ (Kunze & Furness, 1999). Эти медиаторы играют центральную роль в контроле моторики, и изменения в их экспрессии часто ответственны за нарушение моторики желудочно-кишечного тракта или связаны с ним (Di Nardo et al. 2008)).

Изменения экспрессии нейромедиаторов могут происходить в физиологических условиях, таких как рост или старение. В частности, в постнатальный период иммунореактивности в клетках мышечной ткани кишечника и иммунореактивности везикулярного переносчика ацетилхолина в волокнах было связано возрастное увеличение доли холинацетилтрансферазы (ChAT) в иммунореактивности, связанной с развитием перистальтики толстой кишки у мышей и крыс (Roberts и др., , 2007 г .; de Vries, и др. 2010)). Напротив, во время старения сообщалось о потере нитрергических и холинергических нейронов (Takahashi et al. 2000; Phillips, 2003)). Фенотип ENS также может модулироваться факторами окружающей среды как эндогенного, так и экзогенного (просветного) происхождения. В частности, клеточные компоненты нейрональной среды, такие как иммунные клетки, кишечная глия или даже кишечные эпителиальные клетки, могут напрямую модулировать экспрессию ключевых нейромедиаторов или ферментов в кишечных нейронах и влиять на подвижность ЖКТ (Schemann et al. 2005; Aubé et al. 2006; Moriez et al. 2009)).

Напротив, гораздо меньше известно о роли просветных факторов, в частности, пищевого происхождения, в контроле нейрохимического кодирования ENS. Недавнее исследование показало, что такое влияние, как бутират, увеличивает долю холинергических нейронов и холинергическую нервно-мышечную передачу, что приводит к усилению транзита через толстую кишку (Soret et al. 2010)). Однако влияние длительного воздействия других диетических факторов на фенотип ENS остается плохо документированным.В частности, остается неизвестным, могут ли диеты, приводящие к ожирению, такие как западная диета (WD) с высоким содержанием насыщенных жирных кислот и простых углеводов, к нейропластическим изменениям в ENS и могут ли эти изменения повлиять на моторику желудочно-кишечного тракта.

Было показано, что определение диетического жира в кишечнике регулирует функции ЖКТ. Модуляция этого ощущения с помощью диеты может способствовать дисфункции желудочно-кишечного тракта, наблюдаемой при ожирении, а также играть роль в развитии ожирения (Little & Feinle-Bisset, 2010)).В частности, было показано, что длительное употребление диеты с высоким содержанием жиров способствует опорожнению желудка от твердой пищи. У здоровых добровольцев опорожнение желудка от пробного завтрака с высоким содержанием жиров происходит быстрее после 14 дней диеты с высоким содержанием жиров, чем до этой диеты (Castiglione et al. 2002)). Точно так же опорожнение желудка увеличивается у пациентов, соблюдающих диету с высоким содержанием жиров, по сравнению с пациентами, придерживающимися диеты с низким содержанием жиров (Cunningham et al. 1991)). Однако этих данных по-прежнему мало, и доступно лишь несколько исследований на животных, описывающих влияние диеты с высоким содержанием жиров на функции желудка.Например, у крыс после воздействия диеты с высоким содержанием жиров в течение 14 дней ингибирующий эффект инфузии олеата из тонкой кишки на опорожнение желудка ослабляется по сравнению с крысами, потребляющими диету с низким содержанием жиров (Covasa & Ritter, 2000)). Более того, механизмы и факторы, ответственные за предполагаемые функциональные изменения, вызванные WD, еще предстоит идентифицировать.

Лептин — вероятный кандидат, участвующий в опосредовании этих функциональных изменений (Martínez et al. 1999)). Кроме того, уровни циркулирующего лептина повышаются при ожирении и происходят в основном из белой жировой ткани (Considine et al. 1996)). Однако остается неизвестным, происходят ли изменения лептина в желудке во время ожирения, вызванного диетой (DIO). Кроме того, хотя лептин-индуцированные изменения функций желудка происходят частично за счет модуляции афферента блуждающего нерва (Cakir et al. 2007)), влияние лептина на ENS остается неизвестным. Хотя было показано, что лептин увеличивает активность кишечных кишечных нейронов (Liu et al. 1999; Reichardt et al. 2011)), его влияние на фенотип и функцию ENS в желудке еще предстоит идентифицировать.

В настоящем исследовании мы стремились охарактеризовать влияние DIO на фенотип нейронов тонкой кишки в антральном отделе и тощей кишке и его функциональное влияние на моторику, а также идентифицировать факторы, участвующие в этих модификациях.

Методы

Этическое разрешение

Эксперименты проводились в соответствии с экспериментальным протоколом исследования на животных, одобренным Комитетом по уходу и использованию животных Inserm.

Протокол эксперимента

Самцов мышей C57BL / 6J Rj в возрасте 4 недель (Janvier Laboratory, Le Genest-Saint-Isle, Франция) содержали в цикле 12 ч свет — 12 ч темнота (22 ° C) и имели свободный доступ к еда и вода.Как описано ранее (Begriche et al. 2008)), после 1-недельного периода адаптации животных случайным образом распределяли для получения в течение 12 недель либо обычного корма (группа ND, очищенная диета 210, SAFE, Augy, France) или Западная диета (группа WD, очищенная диета 230 HF, БЕЗОПАСНАЯ). Вес тела и потребление пищи измеряли еженедельно. Гликемию натощак измеряли в образцах крови из хвостовой вены с помощью глюкометра (Roche, Париж, Франция). Пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT) выполняли, как описано ранее (Andrikopoulos et al. 2008)). Уровни инсулина и лептина в плазме измеряли с помощью наборов для радиоиммуноанализа (RI-13K и ML-82K, соответственно, Linco Research, Сент-Чарльз, Миссури, США). Также использовали мышей db / db (возраст 12 недель, Janvier). Мышей убивали шейным вывихом.

In vivo и ex vivo измерение желудочно-кишечного транзита и сократительной активности

Измерение опорожнения желудка (GE) и транзита через тонкий кишечник in vivo , как описано в дополнительных материалах онлайн.Для фармакологической характеристики ГЭ мышам внутрибрюшинно (внутрибрюшинно) вводили либо 0,9% хлорид натрия (физиологический раствор), либо ингибитор синтазы оксида азота N ^G -нитро-1-аргинин метиловый эфир (l-NAME, 50 мг / кг). ^-1 ; Sigma), как описано ранее (De Winter et al. 2002)). Ex vivo нервно-мышечную передачу в круговой мышце антрального отдела измеряли в камере ванны для органов (дополнительный материал).

Кальциевая визуализация нейронов антрального отдела кишечника

Препараты продольного мышечного и кишечного сплетения (LMMP; 10 × 20 мм) антрального отдела непрерывно перфузировали ледяным раствором Кребса после окрашивания кальций-чувствительным зондом Fluo-4 AM (дополнительный материал).Влияние электростимуляции межганглионарного волокнистого тракта на внутриклеточную концентрацию кальция в ганглиозных структурах регистрировали с помощью сверхбыстрой техники нейровизуализации (дополнительный материал). После экспериментов по нейровизуализации ткани фиксировали и проводили иммуногистохимию, чтобы определить, являются ли отвечающие клетки нейронами или глиальными клетками (дополнительный материал).

Иммуногистохимический анализ

Желудок и около 2 см средней части тощей кишки детубулировали, растягивали и фиксировали в течение ночи в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 4% параформальдегид.После микродиссекции цельные образцы пермеабилизировали в течение 1 часа в PBS / NaN ₃ , содержащем 1% Triton X-100 и 10% ослиной сыворотки, и инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами (дополнительная таблица 1)). После стадии промывки цельные образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со вторичными антителами (дополнительная таблица 1)). Препараты помещали на предметные стекла и просматривали под флуоресцентным микроскопом (Olympus IX50, Франция). Изображения были получены с помощью цифровой камеры (Olympus DP71) и проанализированы с помощью программного обеспечения Cell B.Как описано ранее (Hoff et al. 2008)), два разных ганглия определялись как два отдельных объекта, если их границы были разделены зазором шириной не менее двух нейронов. Количество Hu- и nNOS-иммунореактивных (IR) нейронов, а также глиальных клеток Sox-10-IR подсчитывали по меньшей мере в 20 случайно выбранных ганглиях / ткань / мышь. Чтобы исключить возможность влияния на разницу между группами податливости тканей, мы показали в предварительных экспериментах, что ни площадь ганглиев, ни количество нейронов на ганглии не изменялись амплитудой растяжения, приложенного к ткани до фиксации.

Определение уровней ацетилхолина, GDNF и лептина

Образцы антрального отдела помещали в пробирки Lysing Matrix D (MPBio, Thüringer, Германия), содержащие 500 мкл RIPA (Millipore, Temecula, CA, USA) с ингибиторами протеаз (Roche Diagnostics, Индианаполис, Индиана, США) и гомогенизировали с помощью Precellys 24 (Bertin Technologies, Монтиньи-ле-Бретонне, Франция). Гомогенат центрифугировали, супернатант собирали и хранили при -80 ° C. Уровни ацетилхолина, нейротрофического фактора линии глиальных клеток (GDNF) или лептина измеряли с использованием Amplex Red (Molecular Probes, Юджин, Орегон, США), GDNF E _max (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) или лептина Quantikine (R&D Systems, Mineapolis, MN, USA), соответственно, и нормализованные по концентрации белка.

Роль лептина в модуляции продукции GDNF и в нейропротекции в ENS

Влияние лептина на уровни мРНК GDNF и высвобождение Первичные культуры ENS крыс, полученные, как описано ранее, использовали через 12-13 дней после культивирования ( Chevalier et al. 2008)). Первичные культуры инкубировали в течение 24 ч с различными концентрациями рекомбинантного лептина крысы (R&D Systems). Уровни GDNF измеряли в супернатантах культуры с использованием системы ImmunoAssay E _max (Promega).Количественная ПЦР экспрессии мРНК GDNF была выполнена, как описано ранее (Soret et al. 2010)), с использованием следующих праймеров:

были количественно определены с использованием метода 2 ^{— ΔΔ C t} (Livak & Schmittgen, 2001)) с S6 в качестве внутреннего контроля.

Нейропротекторные эффекты лептина Первичные культуры ENS подвергались воздействию рекомбинантного лептина крысы (100 нг / мл ^-1 ) в течение 24 часов в присутствии или в отсутствие нейтрализующего антитела против GDNF крысы (1 мкг / мл ^-1 ; R&D Systems) или рекомбинантному GDNF крысы (100 нг / мл ^-1 , R&D Systems).Первичные культуры фиксировали и окрашивали антителами против Hu C / D и активной каспазы-3 (дополнительная таблица 1)), как описано ранее (Abdo et al. 2010)). Количество активных клеток каспазы-3-IR и клеток Hu-IR подсчитывали в 15 случайных ганглиях для каждой лунки.

Статистический анализ

Значения выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Тест Манна-Уитни U , тест Крускалла-Уоллиса с последующим тестом множественного сравнения Данна или двусторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Бонферонни проводили с использованием GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США). Результаты считались статистически значимыми, если P <0,05.

Результаты

Характеристика модели ожирения, вызванного диетой

Мыши WD потребляли значительно больше калорий, чем мыши ND (+ 43%, n = 26, P <0,0001) (). Такое потребление калорий привело к значительному увеличению веса уже через 2 недели после начала WD по сравнению с ND. Через 12 недель мыши WD имели на 61% больший вес ( n = 37–38, P <0.0001), чем мышей ND (). В конце диеты у мышей WD увеличилась жировая масса (+ 487%, n = 35–37, P <0,0001), лептинемия (+ 129%, n = 6, P = 0,002). ) и инсулинемии (+ 154%, n = 6, P = 0,005) без каких-либо изменений гликемии натощак ( n = 20, P = 0,09) по сравнению с мышами ND (). Однако после 4 и 8 недель диеты OGTT показало, что площадь под кривой ответа глюкозы была значительно выше у мышей WD по сравнению с мышами ND (, + 24%, n = 19-20, P <0.0001 и + 25%, n = 9–10, P = 0,003 соответственно).

Таблица 1

Характеристика модели ожирения, вызванного диетой

Ожирение, обусловленное диетой 6

Изменения в общей популяции нейронов Чтобы определить влияние DIO на фенотип ENS, количество нейронов Hu-IR на ганглии определяли количественно до диеты (T0) и после 12 недель WD или ND ().Общее количество нейронов Hu-IR в ганглии уменьшалось со временем между T0 и концом ND (, -36%, n = 5-7, P <0,05). Напротив, DIO значительно предотвратил это снижение (, n = 5–8, P > 0,05).

A , иммуногистохимическое маркирование антрального и кишечного сплетения у мышей после 12 недель нормальной диеты (ND) и западной диеты (WD).Нейроны кишечника окрашивали антителами против Hu C / D и против nNOS. Кишечные глиальные клетки окрашивали антителом против Sox-10. Масштабная линейка = 50 мкм. B – D , количественный анализ количества нейронов Hu-IR ( B ), нейронов nNOS-IR ( C ) и клеток Sox-10-IR ( D ) на ганглии проводили в антральном отделе и jejunum у мышей до начала диеты (T0, n = 5) и у мышей после 12 недель ND или WD ( n = 7–11). Значения выражены как среднее ± SEM.* P <0,05, критерий Краскалла – Уоллиса.

Изменения в нитрергической популяции Число нейронов nNOS-IR на ганглий уменьшилось между T0 и концом ND (, -42%, n = 5-7, P <0,05). DIO предотвращал это снижение nNOS-IR нейронов (, n = 5-8, P > 0,05). Это привело к значительно большему количеству нитрергических нейронов на ганглий в конце WD, чем ND (, + 63%, n = 7-8, P <0.05). Что касается холинергической популяции, слабое окрашивание нейронов ChAT-IR и плотная иннервация ChAT-IR волокон в ганглиях препятствовали точному анализу этой популяции нейронов (дополнительный рис. 1)). Поэтому в антральном отделе измеряли содержание ацетилхолина. В конце диеты уровень ацетилхолина был одинаковым у мышей ND и WD (8,9 ± 1,8 и 12,7 ± 2,8 мкмоль (г белка) ^-1 , соответственно, n = 10, P = 0,45).

µCa ²⁺ ½ _i переходные процессы в нейронах антрального отдела кишечника Чтобы оценить различия в степени активации, мы зарегистрировали переходные процессы µCa ²⁺ ½ _i в ответ на стимуляцию межганглионарных импульсов электрической последовательностью волокнистые тракты.Стимуляция вызвала медленно развивающееся увеличение µCa ²⁺ ½ _i с наложенными отдельными пиками (). Эти пики соответствуют разряду потенциала действия (Shuttleworth & Smith, 1999; Michel et al. 2011)). Количество пиков было одинаковым у мышей ND и WD (ND: 9,7 ± 0,1 в 30 клетках, 8 ганглиях и 4 животных против WD: 9,8 ± 0,2 в 19 клетках, 7 ганглиях и 4 животных, P = 0,28 ). Максимальная амплитуда медленного увеличения µCa ²⁺ ½ _i была на 53% выше в миэнтериальных клетках WD по сравнению с мышами ND ( P <0.001) (). Иммуногистохимическое окрашивание PGP 9.5 и S-100 выявило иммунореактивность в 12 из 35 клеток из 5 тканей (3 мыши ND и 2 мыши WD). В остальных 23 клетках иммунореактивность была слишком слабой для проведения надежного анализа. Все клетки, которые ответили на стимуляцию волоконного тракта увеличением µCa ²⁺ ½ _i , ассоциированного с пиками, были идентифицированы как нейроны (10 PGP 9,5-положительных клеток).

A , типичные записи, показывающие ответы кальция в нейроне кишечника при нормальном питании (ND ) мышей и мышей, получавших западную диету (WD), во время и после импульсной стимуляции последовательности межганглионарных волокон.Пики кальция можно наблюдать во время каждого электрического импульса. B , процент изменений флуоресценции в состоянии покоя (Δ F / F ), вызванных последовательными импульсами стимуляции трактов межганглионарных волокон в клетках миэнтериального сплетения (ND: n = 30 клеток, 8 ганглиев, 4 мыши и WD: n = (19 клеток, 7 ганглиев, 4 мыши). Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, критерий Манна – Уитни.

Изменения в кишечных глиальных клетках Наконец, количество клеток Sox-10-IR на ганглий в антральном отделе было одинаковым между T0 и концом ND (, n = 4-7, P > 0.05). Однако после WD количество клеток Sox-10-IR было значительно увеличено по сравнению с ND и T0 (+ 36% и + 38%, соответственно, n = 4-7, P <0,05).

Изменения фенотипа ENS в тощей кишке В тощей кишке не наблюдалось различий в количестве нейронов Hu-IR между разными группами (, n = 5–11, P > 0,05). Однако наблюдалось увеличение числа нейронов nNOS-IR на ганглий в конце WD по сравнению с T0 (, + 21%, n = 5–11, P <0.05). Наконец, количество клеток Sox-10-IR было сходным в разных группах мышей (, n = 5–11, P > 0,05).

Ожирение, вызванное диетой, увеличивало опорожнение желудка и нитрергическую нервно-мышечную передачу в антральном отделе

Для определения предполагаемого функционального воздействия DIO-ассоциированных нейропластических изменений в антральном отделе оценивали опорожнение желудка и нервно-мышечную передачу в антральном отделе.

Исследование in vivo В конце диеты ГЭ значительно увеличилось на 39% ( n = 16-17, P <0.05) у WD по сравнению с мышами ND (). l-NAME значительно снижает GE у WD (–34%, n = 7, P <0,05), но не у мышей ND ( n = 9, P > 0,05) (). Физиологический раствор не изменял GE (данные не показаны). Напротив, транзит по тонкому кишечнику был сходным у мышей ND и WD (, n = 10, P = 0,36).

A , опорожнение желудка от твердых веществ у мышей через 12 недель ND или WD после внутрибрюшинной инъекции физиологического раствора ( n = 16 –17) или раствор l-NAME ( n = 7–9).Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, критерий Краскалла – Уоллиса. B , транзит через тонкий кишечник у мышей после 12 недель ND или WD ( n = 10). Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, критерий Манна – Уитни. C , типичные записи, показывающие EFS-опосредованные сократительные ответы у мышей ND и WD в базовых условиях. D , количественный анализ площади под кривой (AUC), измеренной во время EFS у мышей ND и WD в базовых условиях, в присутствии l-NAME и в присутствии l-NAME и атропина ( n = 25 –27).Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, критерий Краскалла – Уоллиса. E , количественный анализ AUC, чувствительной к l-NAME (ΔAUC; разница между AUC в присутствии l-NAME и AUC без лекарственного средства) у мышей ND и WD ( n = 25–27). Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, критерий Манна – Уитни. F , количественный анализ чувствительной к атропину AUC (ΔAUC; разница между AUC в присутствии l-NAME и атропина и AUC в присутствии l-NAME) у мышей ND и WD ( n = 25–27).Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, критерий Манна – Уитни.

Ex vivo , исследование В базовых условиях стимуляция электрическим полем (EFS) вызывала небольшое снижение базального тонуса в полосках круговых мышц антрального отдела (). Площадь под кривой (AUC) EFS-индуцированного ответа не показала значимой разницы между мышами ND и WD (, n = 25–27, P = 0,24). В обеих группах снижение базального тонуса, вызванное EFS, значительно ингибировалось l-NAME ().Однако чувствительный к l-NAME компонент AUC, индуцированной EFS, был значительно больше у WD по сравнению с мышами ND (). Дальнейшее добавление атропина значительно снизило AUC, вызванную EFS, в обеих группах. В этом последнем состоянии AUC, индуцированная EFS, была значительно выше при WD по сравнению с ND (). Однако чувствительный к атропину компонент AUC, индуцированной EFS, был сходным в обеих группах ().

Ответы на карбахол и нитропруссид натрия (SNP) были одинаковыми в обеих группах (дополнительный рис.2, n = 25, P > 0,05 и n = 7–10, P > 0,05 соответственно).

Ожирение, вызванное диетой, увеличивало экспрессию GDNF в антральном отделе

Затем мы определили, может ли DIO-индуцированное предотвращение возрастных изменений в ENS быть связано с повышенной экспрессией нейропротекторных факторов, таких как GDNF. У мышей ND концентрация GDNF в антральном отделе оставалась постоянной на протяжении всей диеты (, n = 5-10, P > 0.05). Напротив, DIO индуцировал зависящее от времени увеличение концентрации GDNF уже после 8 недель диеты (). В конце диеты концентрация GDNF была значительно увеличена на 65% ( n = 10, P <0,05) у мышей WD по сравнению с мышами ND (). Иммуногистохимический анализ выявил экспрессию GDNF и Ret на уровне нейронов, тогда как экспрессия GFRα1 была обнаружена как в нейронах, так и в глиальных клетках (дополнительный рис. 3)).

A , изменение концентрации GDNF в антральном отделе у мышей перед диетой ( n, = 5) и через 4 недели ( n = 5), 8 недель ( n = 5) и 12 недель ( n = 10) нормальной диеты (ND) или западной диеты (WD). Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, двусторонний дисперсионный анализ. B , изменение концентрации лептина в антральном отделе у мышей до диеты ( n = 5) и через 4 недели ( n = 5), 8 недель ( n = 5) и 12 недель ( n = 10) ND или WD.Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, двусторонний дисперсионный анализ. C , иммуногистохимическое мечение антрального мышечно-кишечного сплетения с помощью анти-ObR, анти-PGP 9.5 и анти-GFAP антител. Клетки ObR-IR коэкспрессировали PGP 9.5 (стрелки) и GFAP (стрелки). Масштабная линейка = 50 мкм. D , концентрация GDNF в антральном отделе у мышей WT в возрасте 12 недель, db / + и db / db ( n = 4-7). Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0.05, тест Краскалла – Уоллиса. E , концентрация GDNF в супернатантах первичных культур ENS, обработанных различными дозами лептина в течение 24 ч, нормализованная к контролю ( n = 14–23; контроль 69,5 ± 5,4 пг мл ^–1 ). Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с контролем , критерий Краскалла – Уоллиса.

Лептин участвует в регуляции продукции GDNF

Параллельно с изменениями концентрации GDNF мы также охарактеризовали влияние DIO на лептин.Не было зависимых от времени изменений концентрации лептина в антральном отделе во время ND (, n = 5–10, P > 0,05). Напротив, DIO индуцировал зависящее от времени увеличение концентрации лептина уже после 4 недель диеты (). В конце диеты концентрация лептина увеличилась на 753% ( n = 10, P <0,001) у мышей WD по сравнению с мышами ND ().

Следовательно, мы проверили гипотезу о том, что лептин может участвовать в регуляции продукции GDNF.Рецепторы лептина были экспрессированы как в нейронах, так и в некоторых глиальных клетках антрального отдела () и в первичной культуре ENS. У мышей db / db (лишенных рецепторов лептина) мы показали, что антральная концентрация GDNF была значительно снижена по сравнению с мышами WT (-88%, n = 4-7, P <0,05) . Кроме того, лептин индуцировал значительное увеличение содержания GDNF в супернатантах первичной культуры ENS (, n = 14–23, P <0,05).Лептин (1 нг мл ^-1 ) также индуцировал значительное увеличение экспрессии мРНК GDNF по сравнению с контролем (3,4 ± 0,7 против 1,2 ± 0,3 соответственно, n = 5, P = 0,03).

Лептин обладал нейропротекторным действием через GDNF

Наконец, были исследованы нейропротекторные эффекты лептина и участие GDNF в этих эффектах. Лептин значительно снизил на 86% ( n = 10–12, P <0,05) долю активных нейронов каспазы-3-IR в первичной культуре ENS по сравнению с контрольными условиями ().Эффект лептина отменялся нейтрализующими антителами против GDNF (, n = 10–13, P > 0,05). Наконец, мы показали, что GDNF значительно снижает на 91% ( n = 5–7, P = 0,03) долю активных нейронов каспазы-3-IR по сравнению с контролем ().

A , процент активных нейронов каспазы-3-IR (от общего количества нейронов Hu-IR) в первичных культурах ENS, обработанных лептином и нейтрализующим антителом против GDNF (нейтрализующим GDNF .Ab) и нормализовали к контролю ( n = 10–13; контроль: 0,48 ± 0,23%). Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, критерий Краскалла – Уоллиса. B , процент активных нейронов каспазы-3-IR (от общего количества нейронов Hu-IR) в первичных культурах ENS, обработанных GDNF и нормализованных к контролю ( n = 5-7; контроль: 0,25 ± 0,08%). Значения выражены как среднее ± SEM. * P <0,05, критерий Манна – Уитни.

Обсуждение

Это исследование продемонстрировало, что DIO индуцировал нейропластические изменения в антральном отделе, ведущие к NO-зависимому ускорению GE.В частности, DIO предотвращал возрастную потерю нейронов кишечника и кишечника желудка, особенно нитрергических, наблюдаемую у мышей ND. Кроме того, во время WD, но не ND, происходило зависящее от времени увеличение концентраций лептина и GDNF в антральном отделе. Наконец, лептин увеличивал продукцию GDNF в ENS и индуцировал нейропротекторные эффекты, частично опосредованные GDNF.

Важным открытием нашего исследования было то, что DIO предотвращал возрастные нейропластические изменения в антральном отделе. В самом деле, в антральном отделе мышей ND количество нейронов в ганглии уменьшилось на 36% в процессе диеты (т.е.е. в возрасте от 5 до 17 недель), в то время как они сохранялись у тучных мышей. Связанная с возрастом потеря нейронов тонкой кишки уже сообщалась в антральном отделе мышей в течение первого года жизни (El-Salhy et al. 1999)). Подобно нашим результатам, потеря нейронов началась после 12-недельного возраста и достигла 30% на 52-й неделе по сравнению с 4-недельными мышами (El-Salhy et al. 1999)). Однако, поскольку мыши, использованные в нашем исследовании, еще молоды (т.е. 5 недель), наблюдаемые эффекты DIO также могут быть результатом вмешательства диеты в нормальный процесс созревания ENS, происходящий в этот период.Кроме того, мы также определили, что нитрергические нейроны зависят от возраста. Хотя данных по антральному отделу нет, в различных исследованиях сообщалось о возрастной потере нитрергических нейронов кишечника в толстой кишке крыс и мышей (Takahashi et al. 2000; Liu et al. 2009). Это увеличение плотности нейронов и, в частности, нейронов NOS-IR может быть ответственно за более высокую концентрацию Ca ²⁺ , индуцированную стимуляцией нервных волокон в ENS у WD по сравнению с мышами ND.Действительно, было показано, что NO увеличивает внутриклеточную концентрацию кальция в нейронах кишечника (Sitmo et al. 2007)).

Другой вывод этого исследования заключался в том, что эффекты DIO на нитрергические нейроны имели функциональное влияние на ГЭ и нервно-мышечную передачу в антральном отделе. Действительно, после 12 недель диеты количество нейронов nNOS-IR было значительно больше в антральном отделе мышей WD, чем у мышей ND. Следовательно, амплитуда как NO-зависимой нервно-мышечной передачи, так и NO-зависимой GE была увеличена у мышей WD по сравнению с мышами ND.Кроме того, в нашем исследовании не наблюдалось изменений холинергической нервно-мышечной передачи, что согласуется с отсутствием эффектов DIO на содержание ацетилхолина в антральном отделе. Наши данные соответствуют ключевой роли NO в управлении GE. Действительно, у мышей nNOS KO уровень GE был снижен (Mashimo et al. 2000)), а введение ингибиторов биосинтеза NO задерживало GE у крыс и мышей (Plourde et al. 1994; Orihata & Sarna, 1994)). Аналогичным образом, индуцированное WD увеличение ГЭ, наблюдаемое у мышей, согласуется с исследованиями у пациентов, демонстрирующих ускорение ГЭ после перехода на диету с высоким содержанием жиров (Cunningham et al. 1991; Castiglione et al. 2002)) или при ожирении (Cardoso-Júnior et al. 2007)). Это увеличение ГЭ может также участвовать в развитии ожирения, подавляя чувство насыщения и увеличивая потребление пищи. Это также подтверждает ключевую роль моторики желудка в контроле потребления пищи и в долгосрочном регулировании массы тела (Janssen et al. 2011)).

Мы также продемонстрировали, что эффекты DIO частично опосредуются лептином и GDNF.Мы впервые показали, что DIO увеличивает содержание лептина в антральном отделе уже после 4 недель диеты. Этот временной ход изменений лептина в желудке аналогичен тому, который наблюдается в плазме при диете с высоким содержанием жиров (Collin et al. 2006; Sutherland et al. 2008)). Затем мы продемонстрировали, что лептин может индуцировать синтез и высвобождение GDNF посредством ENS. Сначала мы идентифицировали рецепторы лептина в нейрональных и глиальных структурах антрального отдела, что согласуется с предыдущим исследованием, показывающим экспрессию рецепторов лептина на нейронах кишечника подвздошной кишки (Liu et al. 1999)). Хотя роль лептина в регуляции продукции GDNF в центральной нервной системе (ЦНС) и ENS никогда не описывалась, лептин может увеличивать секрецию других нейротрофинов, таких как нейротрофический фактор головного мозга в ЦНС (Komori et al. 2006)). Механизмы, участвующие в регуляции секреции GDNF лептином, остаются неизвестными, но могут включать STAT3, поскольку (1) IL-1β увеличивает высвобождение GDNF клетками глиомы крысы посредством STAT3-зависимого механизма (Tanabe et al. 2009)) и (2) лептин увеличивал фосфорилирование STAT3 в нейронах узловых ганглиев (de Lartigue et al. 2011)).

Мы наконец продемонстрировали, что лептин оказывает нейропротекторное действие частично через GDNF, хотя мы не можем исключить прямое действие лептина. Нейропротекторные эффекты лептина никогда не были выявлены в центральной или периферической нервной системе. Однако было показано, что лептин оказывает цитопротекторное действие на линии нейрональных клеток во время окислительного стресса (Lu et al. 2006; Weng et al. 2007)). Более того, наблюдаемая нами нейропротекторная роль GDNF согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими, что GDNF увеличивает выживаемость постнатальных нейронов кишечника (Rodrigues et al. 2011)). GDNF также предотвращал вызванную гипергликемией потерю нейронов кишечника, особенно нитрергических, у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином (Anitha et al. 2006). Эти результаты также согласуются с данными, показывающими, что у мышей GDNF +/– в желудке меньше нейронов кишечника, чем у животных дикого типа (Shen et al. 2002)). Хотя в нашем исследовании для характеристики эффектов лептина и GDNF использовались разные животные модели, нейропротекторные эффекты лептина в ENS и GDNF были описаны у различных видов, таких как мыши, крысы и морские свинки (Liu et al. 1999; Anitha и др., , 2006 г .; Reichardt, , и др., , 2011 г.)). Наше исследование также распространяет защитные эффекты лептина, описанные в желудке, на ENS. Действительно, в желудке лептин оказывает защитное действие на слизистые оболочки и способствует процессам восстановления (Brzozowski et al. 1999; Konturek et al. 2001)). Интересно, что также было показано, что GDNF защищает эпителиальный барьер кишечника (Zhang et al. 2010)). Следовательно, есть соблазн предположить центральную роль лептина и GDNF в регуляции нейронального и барьерного гомеостаза в желудке.

Общие защитные эффекты DIO, наблюдаемые в нашем исследовании, могут быть неожиданными в отношении долгосрочных побочных эффектов ожирения. Однако наша модель, вероятно, отражает более ранние фазы ожирения.В частности, наши результаты убедительно свидетельствуют о том, что ДИО может оказывать благотворное влияние на функции желудка за счет активации лептина. Однако потеря чувствительности к лептину, наблюдаемая в последних фазах ожирения после 20 недель диеты с высоким содержанием жиров у мышей (Lin et al. 2000)), может привести к потере нейропротективных эффектов DIO и способствовать развитию кишечные невропатии и дисфункции ЖКТ.

В заключение, наше исследование продемонстрировало, что DIO индуцировал изменения функций желудка, характеризующиеся увеличением опорожнения желудка.Эти функциональные изменения были связаны с предотвращением возрастной гибели нейрональных клеток, которая, вероятно, связана с выработкой лептина и GDNF. Нутритивное вмешательство с использованием полезных для WD факторов (таких как лептин или GNDF) может быть использовано в качестве нового терапевтического подхода в лечении кишечных невропатий желудка и связанных с ними дисфункций. Кроме того, это исследование определяет ENS как новый субъект, вовлеченный в желудочно-кишечные дисфункции, связанные с ожирением, которые могут способствовать развитию ожирения.

Благодарности

Мы благодарим Биргит Куч и Мэнди Биро за их техническую поддержку. Это исследование было поддержано грантами Fondation pour la Recherche Médicale, Национального агентства исследований (ALIA 2009), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG Sche 267 / 8-1) и фармацевтической компании Nycomed. Шарлотта Бодри — получатель исследовательского гранта Французского министерства государственной власти.

Глоссарий

Сокращения

Вклад авторов

C.Б. и Р.М. внес вклад в концепцию и дизайн экспериментов, сбор, анализ и интерпретацию данных, а также в составление статьи и критическую переработку важного интеллектуального содержания. С.Б.В., М.С. и М. участвовал в разработке концепции и дизайна экспериментов, а также в переработке статьи на предмет важного интеллектуального содержания. F.R., J.M. и A.B. внес свой вклад в концепцию и дизайн экспериментов, а также в сбор, анализ и интерпретацию данных. Мы подтверждаем, что все авторы одобрили окончательную версию рукописи и не имели конфликта интересов, о котором следует сообщать.

Дополнительный материал

Дополнительная таблица 1

Дополнительный рисунок 1

Дополнительный рисунок 2

Дополнительный рисунок 3

В качестве услуги нашим авторам и читателям этот журнал предоставляет вспомогательную информацию. авторы. Такие материалы рецензируются и могут быть реорганизованы для онлайн-доставки, но не редактируются или набираются. По вопросам технической поддержки, возникающим в связи с дополнительной информацией (кроме отсутствующих файлов), следует обращаться к авторам.

Ссылки

• Abdo H, Derkinderen P, Gomes P, Chevalier J, Aubert P, Masson D, Galmiche JP, Vanden Berghe P, Нойнлист М, Лардо Б.Кишечные глиальные клетки защищают нейроны от окислительного стресса частично за счет восстановленного глутатиона. FASEB J. 2010; 24: 1082–1094. [PubMed] [Google Scholar]
• Andrikopoulos S, Blair AR, Deluca N, Fam BC, Proietto J. Оценка теста на толерантность к глюкозе у мышей. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2008; 295: E1323 – E1332. [PubMed] [Google Scholar]
• Anitha M, Gondha C, Sutliff R, Parsadanian A, Mwangi S, Sitaraman SV, Srinivasan S. GDNF спасает вызванную гипергликемией диабетическую кишечную невропатию посредством активации пути PI3K / Akt.J Clin Invest. 2006. 116: 344–356. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Aubé AC, Cabarrocas J, Bauer J, Philippe D, Aubert P, Doulay F, Liblau R, Galmiche JP, Neunlist M. Изменения фенотипа кишечных нейронов и функций кишечника у трансгенная модель разрушения кишечной глии у мышей. Кишечник. 2006; 55: 630–637. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Begriche K, Lettéron P, Abbey-Toby A, Vadrot N, Robin MA, Bado A, Pessayre D, Fromenty B. Частичный дефицит лептина способствует ожирению, вызванному диетой, и связанным с ним метаболические нарушения у мышей.Am J Physiol Endocrinol Metab. 2008; 294: E939 – E951. [PubMed] [Google Scholar]
• Brzozowski T, Konturek PC, Konturek SJ, Pajdo R, Duda A, Pierzchalski P, Bielański W, Hahn EG. Лептин в гастропротекции, вызванной холецистокинином или приемом пищи. Роль блуждающих и чувствительных нервов и оксида азота. Eur J Pharmacol. 1999. 374: 263–276. [PubMed] [Google Scholar]
• Cakir B, Kasimay O, Devseren E, Yeğen BC. Лептин подавляет опорожнение желудка у крыс: роль рецепторов CCK и афферентных волокон блуждающего нерва.Physiol Res. 2007. 56: 315–322. [PubMed] [Google Scholar]
• Cardoso-Júnior A, Coelho LGV, Savassi-Rocha PR, Vignolo MC, Abrantes MM, de Almeida AM, Dias EE, Vieira Júnior G, de Castro MM, Lemos YV. Опорожнение желудка от твердых и полутвердых веществ у субъектов с патологическим ожирением и без ожирения: оценка с использованием дыхательных тестов ¹³ C-октановой кислоты и ¹³ C-уксусной кислоты. Obes Surg. 2007; 17: 236–241. [PubMed] [Google Scholar]
• Castiglione KE, Read NW, French SJ. Адаптация к диете с высоким содержанием жиров ускоряет избавление от жировых пробных блюд, но не от углеводов.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2002; 282: R366 – R371. [PubMed] [Google Scholar]
• Chevalier J, Derkinderen P, Gomes P, Thinard R, Naveilhan P, Vanden Berghe P, Neunlist M. Зависимая от активности регуляция экспрессии тирозингидроксилазы в кишечной нервной системе. J Physiol. 2008; 586: 1963–1975. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Collin P, Chapados N, Dufresne E, Corriveau P, Imbeault P, Lavoie JM. Динамика изменений in vitro липолиза внутрибрюшных жировых отложений в отношении стеатоза печени у крыс, вызванного диетой с высоким содержанием жиров.Br J Nutr. 2006; 96: 268–275. [PubMed] [Google Scholar]
• Considine RV, Sinha MK, Heiman ML, Kriauciunas A, Stephens TW, Nyce MR, Ohannesian JP, Marco CC, McKee LJ, Bauer TL. Концентрации иммунореактивного лептина в сыворотке крови у людей с нормальным весом и ожирением. N Engl J Med. 1996. 334: 292–295. [PubMed] [Google Scholar]
• Covasa M, Ritter RC. Адаптация к диете с высоким содержанием жиров снижает подавление опорожнения желудка ХЦК и кишечным олеатом. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2000; 278: R166 – R170.[PubMed] [Google Scholar]
• Cunningham KM, Daly J, Horowitz M, Read NW. Адаптация желудочно-кишечного тракта к диетам с различным жировым составом у людей-добровольцев. Кишечник. 1991; 32: 483–486. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Эль-Салхи М., Сандстрём О., Холмлунд Ф. Изменения кишечной нервной системы у мышей, вызванные возрастом. Mech Aging Dev. 1999; 107: 93–103. [PubMed] [Google Scholar]
• Hoff S, Zeller F, von Weyhern CWH, Wegner M, Schemann M, Michel K, Rühl A. Количественная оценка глиальных клеток в кишечной нервной системе человека и морской свинки с помощью анти-Sox8 / 9/10 антитело.J Comp Neurol. 2008; 509: 356–371. [PubMed] [Google Scholar]
• Janssen P, Vanden Berghe P, Verschueren S, Lehmann A, Depoortere I, Tack J. Обзорная статья: роль перистальтики желудка в контроле приема пищи. Алимент Pharmacol Ther. 2011; 33: 880–894. [PubMed] [Google Scholar]
• Комори Т., Морикава Ю., Нанджо К., Сенба Э. Индукция лептином нейротрофического фактора мозга в вентромедиальный гипоталамус. Неврология. 2006. 139: 1107–1115. [PubMed] [Google Scholar]
• Konturek PC, Brzozowski T, Sulekova Z, Brzozowska I, Duda A, Meixner H, Hahn EG, Konturek SJ.Роль лептина в заживлении язв. Eur J Pharmacol. 2001; 414: 87–97. [PubMed] [Google Scholar]
• Кунце В.А., Фернесс Дж.Б. Кишечная нервная система и регуляция перистальтики кишечника. Annu Rev Physiol. 1999. 61: 117–142. [PubMed] [Google Scholar]
• de Lartigue G, Barbier de la Serre C, Espero E, Lee J, Raybould HE. Ожирение, вызванное диетой, приводит к развитию резистентности к лептину в афферентных нейронах блуждающего нерва. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2011; 301: E187 – E195. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lin S, Thomas TC, Storlien LH, Huang XF.Развитие ожирения, вызванного диетой с высоким содержанием жиров, и резистентности к лептину у мышей C57Bl / 6J. Int J Obes Relat Metab Disord. 2000. 24: 639–646. [PubMed] [Google Scholar]
• Little TJ, Feinle-Bisset C. Оральное и желудочно-кишечное зондирование диетического жира и регуляция аппетита у людей: модификация диетой и ожирением. Front Neurosci. 2010; 4: 178. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Лю М., Сейно С., Кирхгесснер А.Л. Идентификация и характеристика глюкорезонансных нейронов кишечной нервной системы.J Neurosci. 1999; 19: 10305–10317. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Liu M-T, Kuan Y-H, Wang J, Hen R, Gershon MD. Опосредованная рецептором 5-HT4 нейрозащита и нейрогенез в кишечной нервной системе взрослых мышей. J Neurosci. 2009; 29: 9683–9699. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ливак К.Дж., Шмиттген Т.Д. Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2 ^{-ΔΔ C (T)} . Методы. 2001; 25: 402–408.[PubMed] [Google Scholar]
• Лу Дж., Пак К. С., Ли С. К., Шин Д. В., Кан Дж. Х. Лептин подавляет гибель клеток SH-SY5Y, вызванную 1-метил-4-фенилпиридинием. Neurosci Lett. 2006; 407: 240–243. [PubMed] [Google Scholar]
• Martínez V, Barrachina MD, Wang L, Taché Y. Внутрицеребровентрикулярный лептин подавляет опорожнение желудка от твердой питательной пищи у крыс. Нейроотчет. 1999; 10: 3217–3221. [PubMed] [Google Scholar]
• Машимо Х, Челлин А., Гоял РК. Желудочный застой у нейрональных мышей с дефицитом синтазы азота.Гастроэнтерология. 2000; 119: 766–773. [PubMed] [Google Scholar]
• Michel K, Michaelis M, Mazzuoli G, Mueller K, VandenBerghe P, Schemann M. Быстрая визуализация чувствительных к кальцию и напряжению красителей в кишечных нейронах выявляет пики кальция, связанные с разрядом с единичным потенциалом действия. J Physiol. 2011; 589: 5941–5947. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Moriez R, Abdo H, Chaumette T, Faure M, Lardeux B., Neunlist M. Нейропластичность и нейрозащита в кишечных нейронах: роль эпителиальных клеток.Biochem Biophys Res Commun. 2009; 382: 577–582. [PubMed] [Google Scholar]
• Di Nardo G, Blandizzi C, Volta U, Colucci R, Stanghellini V, Barbara G, Del Tacca M, Tonini M, Corinaldesi R, De Giorgio R. Обзорная статья: молекулярные, патологические и терапевтические особенности кишечных невропатий человека. Алимент Pharmacol Ther. 2008; 28: 25–42. [PubMed] [Google Scholar]
• Orihata M, Sarna SK. Ингибирование синтазы оксида азота задерживает опорожнение желудка от твердой пищи. J Pharmacol Exp Ther.1994; 271: 660–670. [PubMed] [Google Scholar]
• Филлипс Р. Старение мышечно-кишечного сплетения: потеря нейронов специфична для холинергических нейронов. Auton Neurosci. 2003. 106: 69–83. [PubMed] [Google Scholar]
• Plourde V, Quintero E, Suto G, Coimbra C, Taché Y. Задержка опорожнения желудка, вызванная ингибиторами синтазы оксида азота у крыс. Eur J Pharmacol. 1994; 256: 125–129. [PubMed] [Google Scholar]
• Рейхардт Ф., Крюгер Д., Шеманн М. Лептин возбуждает кишечные нейроны подслизистого и миэнтерического сплетения морских свинок.Нейрогастроэнтерол Мотил. 2011; 23: e165 – e170. [PubMed] [Google Scholar]
• Робертс Р.Р., Мерфи Дж. Ф., Янг Х. М., Борнштейн Дж. Развитие моторики толстой кишки в исследованиях на неонатальных мышах с использованием пространственно-временных карт. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007; 292: G930 – G938. [PubMed] [Google Scholar]
• Родригес Д.М., Ли А.Ю., Наир Д.Г., Бленнерхассетт М.Г. Нейротрофический фактор, происходящий из глиальных клеток, является ключевым нейротрофином в постнатальной кишечной нервной системе. Нейрогастроэнтерол Мотил.2011; 23: e44 – e56. [PubMed] [Google Scholar]
• Schemann M, Michel K, Ceregrzyn M, Zeller F, Seidl S, Bischoff SC. Коктейль медиаторов тучных клеток человека возбуждает нейроны кишечной нервной системы человека и морских свинок. Нейрогастроэнтерол Мотил. 2005; 17: 281–289. [PubMed] [Google Scholar]
• Шен Л., Пичель Дж. Г., Майели Т., Сариола Х, Лу Б., Вестфаль Х. Гаплонедостаточность GDNF вызывает у мышей кишечную непроходимость по типу Гиршпрунга и раннюю летальность. Am J Hum Genet. 2002. 70: 435–447.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Shuttleworth CW, Smith TK. Зависимые от действия транзиенты кальция в миентеральных S-нейронах подвздошной кишки морских свинок. Неврология. 1999. 92: 751–762. [PubMed] [Google Scholar]
• Ситмо М., Рен М., Динер М. Стимуляция потенциал-зависимых каналов Ca ²⁺ с помощью NO в нейронах мышечной оболочки кишечника крысы. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007; 293: G886 – G893. [PubMed] [Google Scholar]
• Соре Р., Шевалье Дж., Де Коппет П., Пупо Дж., Деркиндерен П., Сегейн Дж. П., Нойнлист М.Короткоцепочечные жирные кислоты регулируют кишечные нейроны и контролируют моторику желудочно-кишечного тракта у крыс. Гастроэнтерология. 2010; 138: 1772–1782. E4. [PubMed] [Google Scholar]
• Sutherland LN, Capozzi LC, Turchinsky NJ, Bell RC, Wright DC. Динамика снижения митохондриальных белков жировой ткани, вызванного диетой с высоким содержанием жиров: потенциальные механизмы и связь с непереносимостью глюкозы. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2008; 295: E1076 – E1083. [PubMed] [Google Scholar]
• Takahashi T., Qoubaitary A, Owyang C, Wiley JW.Снижение экспрессии синтазы оксида азота в кишечном сплетении и кишечнике у старых крыс. Brain Res. 2000; 883: 15–21. [PubMed] [Google Scholar]
• Tanabe K, Nishimura K, Dohi S, Kozawa O. Механизмы индуцированного интерлейкином-1β высвобождения GDNF из клеток глиомы крысы. Brain Res. 2009; 1274: 11–20. [PubMed] [Google Scholar]
• de Vries P, Soret R, Suply E, Heloury Y, Neunlist M. Постнатальное развитие нейрохимического фенотипа кишечника и влияние на нейромышечную передачу в толстой кишке крыс.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010; 299: G539 – G547. [PubMed] [Google Scholar]
• Weng Z, Signore AP, Gao Y, Wang S, Zhang F, Hastings T, Yin XM, Chen J. Лептин защищает от индуцированной 6-гидроксидофамином дофаминергической гибели клеток через митоген-активированную протеинкиназу сигнализация. J Biol Chem. 2007; 282: 34 479–34 491. [PubMed] [Google Scholar]
• De Winter BY, Bredenoord AJ, De Man JG, Moreels TG, Herman AG, Pelckmans PA. Влияние ингибирования индуцибельной синтазы оксида азота и гуанилилциклазы на вызванную эндотоксином задержку опорожнения желудка и кишечного транзита у мышей.Шок. 2002. 18: 125–131. [PubMed] [Google Scholar]
• Zhang DK, He FQ, Li TK, Pang XH, Cui DJ, Xie Q, Huang XL, Gan HT. Глиальный нейротрофический фактор регулирует барьерную функцию кишечного эпителия и воспаление и оказывает терапевтическое действие при колите у мышей. J Pathol. 2010. 222: 213–222. [PubMed] [Google Scholar]

Протеомика темной разделочной longissimus thoracis туши телок и бычков

Целью этого исследования было определить влияние степени темной разделки (DC) на нежность, сочность и вкус атрибуты говядины.Во время сортировки туш на крупном промышленном предприятии по заготовке говядины в США были отобраны туши DC (n = 160) и соответствующие туши нормального контроля (NC) (n = 160). Был определен pH длинной мышцы поясницы (LL), и тушки DC были классифицированы как тяжелые (тяжелый темный разрез [SEDC]; средний pH = 6,9; n = 40), средний (средний темный разрез [MODC]; средний pH = 6,6; n = 40 ), мягкий (умеренно темный резак [MIDC]; средний pH = 6,4; n = 40) или тенистый (затененный темный резак [SHDC]; средний pH = 6,1; n = 40). Стрипы получали с левых сторон туши, упаковывали под вакуумом и выдерживали при 1 ° C.Сила сдвига (SSF) была измерена (14 дней после убоя) свежих (никогда не замороженных), и обученный описательный сенсорный анализ нежности, сочности и вкуса был измерен (13 дней после смерти) на замороженных / размороженных стейках LL. Приготовленные кусочки SSF замораживали и использовали для вестерн-блоттинга десмина для определения степени посмертного протеолиза. Потери при оттаивании и варке уменьшались по мере увеличения интенсивности постоянного тока, при этом SEDC имел самые низкие потери (1,83 и 10,1%, соответственно) по сравнению с NC (3,37 и 14,9%, соответственно).Сила сдвига среза была выше (P <0,05) для SHDC (25,6 кг) и MIDC (22,9 кг) по сравнению с SEDC (16,8 кг), MODC (19,4 кг) и NC (17,8 кг). Длина саркомера была короче (P <0,05) между классом DC (1,66, 1,67, 1,71 и 1,73 мкм для SEDC, MODC, MIDC и SHDC, соответственно) и NC (1,86 мкм). Посмертный протеолиз десмина был выше (P <0,05) для NC по сравнению со всеми классами DC (59,83% против 49,20, 40,31, 42,07 и 43,30% для SEDC, MODC, MIDC и SHDC, соответственно). Оценки чувствительности обученной сенсорной панели различались (P <0.05) среди класса DC с SEDC (6,51) самым нежным, за ним следуют MODC (6,04), а затем MIDC (5,19), тогда как SHDC (4,66) и NC (4,93) были самыми жесткими. Оценки сочности различались (P <0,05) для каждого класса DC (5,9, 5,7, 5,4 и 5,2 для SEDC, MODC, MIDC и SHDC, соответственно), без разницы между MIDC или SHDC по сравнению с NC (5,23). Жирный, прогорклый, нагретый масляный, химический и затхлый / землистый / хумус привкус увеличивался (P <0,05), тогда как металлический, кислый и соленый привкус уменьшался по мере увеличения тяжести DC.Это исследование показало, что DC и NC различаются нежностью, сочностью и вкусом LL. Направление и / или величина этих различий в значительной степени зависели от степени тяжести постоянного тока. Стейки с промежуточным pH (SHDC и MIDC), скорее всего, будут жесткими и регулярно включаются в линейки продуктов USA Select и USA Choice.

Различия в экспрессии генов в цельной крови, связанные с течением времени заражения и степенью смертности плода в репродуктивной модели инфекции, вызванной вирусом репродуктивного и респираторного синдрома свиней 2 типа (PRRSV)

Временные изменения экспрессии генов цельной крови у свиней, инфицированных вирусом РРСС

Всего 1954 гена были идентифицированы как дифференциально экспрессируемые между D2 и D0 после инокуляции от всех свинок (n = 16).Между D6 и D2 по-разному экспрессировались 1592 гена. Всего 1098 генов по-разному экспрессировались в обоих контрастах, причем почти все гены (1091) увеличивали экспрессию на D2 и снижали на D6 (909) или наоборот (182) (S1 Приложение). Что касается функциональной аннотации, 84 пути были обогащены DEG из контраста D2 v D0 (80 из генов с повышенной регуляцией в D2; 4 из генов с пониженной регуляцией в D2) и 105 путей были обогащены DEG из контраста D6 v D2 (17 в генах с усиленной регуляцией в D6; 88 в генах с пониженной регуляцией в D6) (S2 Приложение).

Передача сигналов интерферона была наиболее значимым путем, активируемым на D2 по сравнению с D0. Это также был один из наиболее значимых путей, которые нужно подавлять на D6 по сравнению с D2. Многие из DEG, которые активируются или регулируют передачу сигналов интерферона, являются общими для сигнальных путей типа I и II, но также были идентифицированы некоторые гены, специфичные для передачи сигналов типа I или типа II, что свидетельствует о том, что оба пути, вероятно, участвуют в первоначальный ответ на прививку вируса РРСС. ДЭГ, которые участвуют или регулируются передачей сигналов интерферона типа I (в основном интерферон альфа или бета) и / или типа II (интерферон гамма) и картируются с путями IPA, включают факторы транскрипции IRF1 , IRF9 , STAT1 и STAT2 , другие ферменты сигнальной трансдукции ( JAK2 , SOCS1 ) и различные молекулы, которые мешают репликации вируса в клетке ( IFIT1 , IFITM1 , MX1 и OAS1 ) (Рисунок 1).

Рис. 1. Передача сигналов интерферона в свиной крови после заражения вирусом РРСС.

Пути передачи сигналов интерферона типа I и II из анализа пути изобретательности. Было обнаружено, что гены, экспрессия которых повышается (красный) в D2 по сравнению с D0 (A), также подавляется (зеленый) в D6 по сравнению с D2 (B). Интенсивность цвета указывает на величину дифференциального выражения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153615.g001

Передача сигналов интерферона является компонентом врожденной иммунной системы и имеет решающее значение для контроля вирусных инфекций за счет подавления репликации вирусов [23].Увеличение передачи сигналов интерферона на D2 и его снижение на D6 отражало изменения белков IFN-α и IFN-γ, наблюдаемые в сыворотке от полного набора свиней из этой модели заражения [11]. Увеличение экспрессии in vivo интерферон-регулируемых генов в тканях свиней, инфицированных вирусом РРСС, также наблюдалось в других транскриптомных анализах [7, 24]. Падение передачи сигналов между D2 и D6 может быть связано с отрицательной обратной связью передачи сигнала или уклонения от иммунитета со стороны вируса.PRRSV использует различные стратегии для нарушения путей передачи сигналов интерферона, что является ключом к его иммуносупрессивным возможностям и стойкому течению инфекции [25].

Наиболее значимым путем, связанным с генами, подавляющими регуляцию в D2 v D0, была передача сигналов фактора инициации трансляции 2 (eIF2) эукариот. EIF2 необходим для инициации синтеза клеточного белка, и 40 DEG на этом пути кодируют белки рибосомных субъединиц ( RPL13A , RPL32 , RPS5 , RPS20 и т. Д.).Сопутствующее усиление передачи сигналов интерферона в один и тот же момент времени может быть напрямую связано с этим феноменом. Ингибирование синтеза клеточного белка является одним из отличительных признаков передачи сигналов интерферона [26], и ген интерферон-индуцируемой киназы, которая негативно регулирует eIF2, EIF2AK2 / PKR , активировался в крови свинок на D2. Было обнаружено, что другие пути синтеза белка также значительно подавлены, включая «регуляцию передачи сигналов eIF4 и p70S6K» и «передачу сигналов mTOR».

Другой биологический процесс, гены которого активируются на D2 до того, как уровни экспрессии упадут на D6, — это воспалительный ответ. Примером этого является путь передачи сигналов TREM1, который является вторым по значимости путем, обогащенным генами, активируемыми на D2, и четвертым наиболее подавляемым на D6. TREM1 — это рецептор клеточной поверхности, который экспрессируется на нейтрофилах, моноцитах и ​​макрофагах. После активации рецепторами распознавания клеточного паттерна (PRR) он способствует воспалению за счет активации факторов транскрипции NF-κB и STAT3 [27].DEG, которые отображаются на этом пути, включают сам TREM1 и фактор транскрипции STAT3 , цитокины (IL1B , TNF , IL10 ), внеклеточные ( TLR2 , TLR4 ) и внутриклеточные TLR4 , TLRs7-9 , NOD1 ) PRR и другие компоненты передачи внутриклеточного сигнала ( MYD88 , JAK2 , LAT2 ). Также были идентифицированы другие пути, связанные с врожденным иммунитетом и воспалением.К ним относятся гены презентации антигена как из путей класса I ( PSMB8, , PSMB9, , SLA-1, , SLA-3, , TAP1, , TAP2, , TAPBP ), так и из путей класса II ( CIIA). , SLA-DMA , SLA-DMB , SLA-DOA , SLA-DQB , SLA-DRA1 и SLA-DRB1 ) и DEG из пути комплемента R ( C1 , C2 , C4A , C3AR1 , C5AR1 , CD55 , CFB , ITGAX и SERPING1 ).

Также было обнаружено, что многие проапоптотические гены активируются на D2, в основном те, которые связаны с сигнальным путем внешнего рецептора смерти.К ним относятся несколько рецепторов смерти, лигандов и ассоциированных сигнальных молекул ( TNF , TNFSF10 / TRAIL , TNFRSF1A , FAS , DAXX , RIPK1 ) и их эффекторные регуляторы casp CASP3 , CASP10 , CFLAR ). Усиление проапоптотической передачи сигналов в D2 соответствует резкому падению абсолютного числа лейкоцитов, включая Т-клетки, и передачи сигналов Т-лимфоцитами в крови свиней, инокулированных вирусом РРСС, в этот момент времени [10] (Рис. 2).Передача сигналов Т-клеточного рецептора (TCR) и связанные с ними пути, такие как «передача сигналов CTLA4 в цитотоксических Т-лимфоцитах» (CTL) и «передача сигналов iCOS-iCOSL в Т-хелперных клетках», подавлялись в D2. ДЭГ, которые картировались с этими путями, включали маркеры поверхности Т-клеток ( CD28 , CD3D , CD3E , CD3G , CD8A и CD8B ) и другие молекулы передачи внутриклеточного сигнала (CS BMX ). , ITK , LCK , MAP3K1 и PIK3CG ).Дополнительные маркеры цитолитической активности также присутствовали среди генов с пониженной регуляцией, таких как гранзимы ( GZMK и GZMM ) и порообразующий белок PRF1.

Рис. 2. Связь между апоптозом и экспрессией гена Т-клеток через два дня после инокуляции вирусом РРСС.

(A) Путь передачи сигнала рецептора Т-клеток из анализа пути изобретательности, показывающий гены, которые подавлены (зеленый) на D2 по сравнению с D0 в цельной крови свинок, инокулированных вирусом РРСС. Интенсивность цвета указывает на величину дифференциального выражения.(B) График среднего числа Т-клеток (CD3 + ve) для 16 экспериментальных свинок в течение первых шести дней заражения, показывающий снижение в течение первых двух дней заражения. Подсчет клеток был получен из ранее опубликованного набора данных [10]. Звездочки указывают на значительные различия в количестве клеток между последовательными временными точками ( P <0,001). (C) Путь передачи сигнала рецептора смерти из анализа пути изобретательности, показывающий гены, которые активированы (красный) на D2 по сравнению с D0. Интенсивность цвета указывает на величину дифференциального выражения.Данные показывают, что апоптоз, по крайней мере, частично ответственен за снижение количества Т-клеток в течение первых двух дней заражения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153615.g002

Апоптотические клетки наблюдались в ряде тканей свиней, инфицированных вирусом РРСС, включая легкие, лимфатические узлы, тимус и репродуктивные ткани [32–35 ]. Интересно, что большинство апоптотических клеток в этих тканях сами не были инфицированы вирусом, что позволяет предположить, что PRRSV может косвенно вызывать апоптоз в неинфицированных клетках-свидетелях.Недавно сообщалось, что вирус РРСС вызывает активацию внешнего пути апоптоза в лимфоцитах и ​​моноцитах инфицированных лимфоидных органов [36]. Данные по экспрессии генов в этой статье подтверждают это открытие, хотя эти результаты требуют дальнейшей проверки с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией, в сочетании с молекулярным анализом для обнаружения апоптозных клеток. Вероятно, что один или несколько цитокинов активируют внешний путь апоптоза, но точный механизм еще предстоит определить.В этом исследовании гены нескольких цитокинов, которые могут запускать апоптоз в лейкоцитах, были идентифицированы как активируемые на D2: они включают IL1B, IL10, TNF и TNFSF10 / TRAIL. Последние два цитокина передают сигнал через рецепторы смерти [37] и, следовательно, являются хорошими кандидатами для опосредования апоптоза через внешний путь в клетках инфицированных свинок, но для подтверждения этого необходимы дальнейшие исследования.

Т-клеток составляли самую большую фракцию лейкоцитов среди PBMC свиней в этом эксперименте.Они также показали наибольшее% снижение количества клеток среди всех основных типов лейкоцитов (T, B, NK и моноциты), протестированных на D2 [10], что, вероятно, объясняет наблюдаемое снижение экспрессии гена маркера Т-клеток. Возможное участие апоптоза в снижении общего количества лейкоцитов уже обсуждалось. Апоптоз лимфоцитов в целом наблюдается в различных тканях, инфицированных вирусом РРСС [33–35]. В частности, апоптоз CD3-положительных Т-клеток и тимоцитов наблюдался в лимфатическом узле, миндалинах и тимусе у поросят, инфицированных вирусом РРСС [32, 38].Т-клетки имеют решающее значение для развития эффективного адаптивного иммунного ответа против инфекции, поэтому индукция апоптоза в этих клетках может способствовать подавлению иммунных ответов во время инфекции PRRSV.

На D6 паттерн экспрессии генов для апоптоза и передачи сигналов Т-клеток был обратным по сравнению с D2: передача сигналов апоптоза подавлялась, в то время как передача сигналов Т-клеток повышалась. Это сопровождалось увеличением количества Т-клеток и увеличением экспрессии генов, которые участвуют в путях, связанных с митозом (рис. 3).К ним относятся «Митотическая роль поло-подобной киназы», ​​«Регуляция контрольной точки повреждения ДНК G2 / M клеточного цикла» и «Контроль клеточного цикла репликации хромосом». Верхние наборы генов относятся к генам, регулируемым двумя факторами транскрипции, участвующими в развитии клеточного цикла: E2F и MYC. Наборы генов «Восстановление ДНК» и «Митотическое веретено» также имели большое значение. Конкретные гены включали циклины ( CCNB1 , CCNB2 , CCNB3 ), регуляторные киназы клеточного деления ( AURKA , CDC7 , CDK1 , CHEK1 , PKM , WEE1 ) и фосфатазы ( CDC25B , CDC25C ), белки комплекса репликации ДНК ( CC45 , CDC6 , MCM2 , MCM3 , MCM4 , MCM4 , MCM4 , RPA1 , RPA3 ) и белки разделения хромосом ( CENPE , CENPM , ESPL1 , FBOX5 , KIF11 , KIF23 , .Этот профиль экспрессии обеспечивает четкое указание на активную клеточную пролиферацию, поскольку многие из механистических компонентов митоза активируются. Известно, что многие из других генов с повышенной активностью экспрессируются в Т-клетках, такие как цитолитические ферменты ( GZMA , GZMB , GZMK ) и белки клеточной поверхности ( CD3D , CD3E , CD3G , CD8B , CTLA4 ). Ранее мы продемонстрировали, что общее количество лейкоцитов у инфицированных свинок восстановилось на 6-й день после инфицирования [10], и что наибольшее увеличение в% произошло во фракции Т-клеток.Эти результаты экспрессии подтверждают это и предполагают, что по крайней мере часть этого восстановления в популяции крови происходит из-за активной пролиферации клеток, а не только из-за притока лейкоцитов в кровоток из других участков. Другие исследования также выявили увеличение CD8B-положительных CTL в периферической крови инфицированных свиней в аналогичный момент времени [39–41]. Неясно, вызвана ли эта пролиферация активацией PRRSV-специфических CTL или более широким ответом CTL на иммуностимулирующий сигнал, такой как поликлональная активация или передача сигналов цитокинов.Роль IL10 в этом процессе постулировалась ранее [40], но мы обнаружили, что пролиферация CTL и экспрессия IL10 отрицательно коррелировали в цельной крови свиней. Независимо от причины увеличение числа CTL действительно предшествует возможному обнаружению IFN-γ с помощью PRRSV-специфических CTL через 2 недели после инфицирования [40]. И хотя появление этого адаптивного иммунного ответа замедлено и слабее, чем у многих вирусных инфекций, оно действительно совпадает с падением виремии, что может указывать на важность клеточного иммунитета для выведения вируса [40].