Вей протеин Direct Whey Protein от Quamtrax ( 900 гр)

Direct Whey Protein от Quamtrax – это концентрат сывороточного протеина, который способствует ускоренному анаболическому росту ваших мышц и более эффективному восстановлению после тренировок.

Давно доказано, что белок молочной сыворотки обладает анаболическим действием, то есть усиливает действие анаболических гормонов, что, в результате, и приводит к росту мышц.

Будучи растворенным в воде, Direct Whey Protein от Quamtrax быстро проходит через желудок и попадает в мышцы менее чем через час! Это делает его лучшим выбором для посттренировочного приема пищи.

Direct Whey Protein от Quamtrax:

• Получен методом микрофильтрации
  
• Отличная растворимость
• Природный источник ВСАА
• Содержание белка – более чем 74%
• Восхитительный вкус

Как принимать протеин

Развести 30 г (1 мерная ложка) в 250—300 мл воды. Лучше употреблять сразу после приготовления.

Рекомендуем употреблять 2 порции в сутки: первая перед завтраком или между приемами пищи, вторая – после тренировки.

Ингредиенты

Порция 30 г
Количество порций 30
Пищевая ценность на:	100 г	30 г
Энергетическая ценность	350 ккал	105 ккал
Жиры	2,09 г	0,65 г
, из которых насыщенные	1,42 г	0,42 г
Углеводы	8,26 г	2,48 г
, из которых сахара	5,47 г	1,64 г
Белки	76,4 г	22,9 г
Соль	0,59 г	0,17 г
Ингредиенты:
концентрат белка молочной сыворотки ультрафильтрат, ароматизаторы, загуститель (ксантановая камедь), подсластитель (сукралоза). Может содержать лактозу и сою, следы глютена, яиц и рыбы.

Где купить сывороточный протеин Direct Whey Protein от Quamtrax?

Вы можете купить в наших магазинах спортивного питания по всей Беларуси. Вы можете приехать в любой магазин нашей сети удобный для Вас локально или же сделать онлайн заказ на нашем сайте. Мы с удовольствием доставим ваш заказа в Минске или же любой населённый пункт Беларуси.

Whey Protein, вей пюре протеин, раздел спортивное питание, производитель Pure Protein, упаковка банка 1000гр

Инструкция для Pure Protein Whey Protein.

Белки молочной сыворотки имеют наивысшую скорость усвоения среди животных белков. Концентрация аминокислот в крови резко возрастает уже в течение первого часа после приема. При этом они не влияют на кислотообразующую функцию желудка, что исключает нарушение его работы. Усваиваемость белков молочной сыворотки исключительно высока.

Аминокислотный состав сывороточных белков наиболее близок к аминокислотному составу мышечной ткани человека, а по содержанию незаменимых аминокислот и аминокислот с разветвленной цепью (ВСАА) — валина, лейцина и изолейцина, они превосходят все остальные белки животного и растительного происхождения. Кроме того, часть белков молочной сыворотки находится в виде аминокислот, которые являются стимуляторами пищеварения и участвуют в синтезе большинства жизненно важных ферментов и гормонов. Также белки молочной сыворотки заметно снижают уровень холестерина в крови.

В Whey Protein (кроме Натурального вкуса), выпускаемый компанией «Pureprotein», в качестве источника протеинов, используется 80% концентрат сывороточного белка, а также зародыши пшеницы и клетчатка. Суммарное количество белка в 1 порции продукта составляет 35,0 г, что соответствует 29,9% рекомендуемой для спортсменов суточной нормы потребления.

Фруктоза. Как и глюкоза, служит быстро утилизируемым источником энергии. Часть фруктозы в печени превращается в глюкозу, которая затем используется для восстановления запасов гликогена. Оставшаяся часть фруктозы, в отличие от глюкозы, усваивается без участия инсулина. Фруктоза усиливает биологическую активность лейцина (аминокислоты с разветвленной цепью), а также нескольких других аминокислот, необходимых для синтеза белка мышц. Кроме того, фруктоза увеличивает всасываемость глюкозы и других питательных веществ. Именно фруктоза обеспечивает организм энергией в период восстановления после нагрузок. Включение фруктозы в состав спортивных продуктов снижает его суммарный гликемический индекс, что важно для людей, контролирующих массу своего тела.

Еще одним компонентом в Whey Protein (кроме Натурального вкуса) является соевый лецитин. Соевый лецитин способствует улучшению переваривания и всасывания жиров, правильному их обмену в организме, обеспечивает снижение содержания холестерина в крови. Ненасыщенные жирные кислоты являются активной частью мембран клеток, регулируют деятельность многих важных процессов в нервной и кроветворной ткани. Рекомендуется в периоды повышенной физической или умственной утомляемости, для увеличения мышечной массы в период интенсивных тренировок и даже для профилактики ускоренного старения.

Кроме того, лецитин оказывает антигипоксическое действие, содействуя повышению скорости диффузии кислорода из легких в кровь и из крови в ткани, нормализуя процессы тканевого дыхания, способствует усвоению многих жирорастворимых витаминов (А, D, Е и К).

В качестве следующего компонента продукта Whey Protein (кроме Натурального вкуса) планируется использовать зародыши пшеницы. Благодаря своим природным свойствам пшеница — это источник множества полезнейших компонентов, удовлетворяющих самые разные потребности организма. Зародыши пшеницы содержат высокую концентрацию ценных веществ. Основные компоненты зародышей пшеницы — это белок, растительные волокна, полисахариды, витамины, микроэлементы, минеральные вещества. Энзимы зародышей пшеницы абсолютно незаменимы для естественных процессов обмена веществ – пищеварения, усваивания активных веществ, воздействия витаминов, окислительных процессов. Благодаря такой палитре жизненно важных элементов зародыши пшеницы компенсируют недостаток активных веществ, регулируют пищеварение, увеличивают поступление кислорода, поддерживают диеты для похудения, придают силы и энергию, улучшают самочувствие.

Что содержится в PureProtein Whey Protein:

Порций в упаковке: 29
Количество питательных веществ в одной порции (2 мерные ложки = 50 г):

Калории 206 ккал
Белки 35 г
Углеводы 11 г
Жиры 2,5 г

Ингредиенты: концентрат сывороточного белка – 80%, фруктоза – 10%, соевый лецитин – 3%, зародыши пшеницы – 3,5%, алкализованный какао-порошок – 1,3%, ароматизаторы – 1%, ксантановая камедь – 1%, аспасвит – 0,2%. Состав может меняться в зависимости от вкусов, но новые компоненты не добавляются.

Рекомендации по применению:
Смешайте в шейкере 2 мерных ложки (50 г) продукта с 300-400 мл воды,молока или другого напитка. Принимайте 2-3 раза в день.
Храните в недоступном для детей и домашних животных месте.
Храните в сухом, защищенном от света месте, при температуре не ниже +6С° изолированно от источников влаги, сильного нагрева или охлаждения.

Информация для аллергиков: может содержать следы сои, пшеничного белка, яичного альбумина.

Протеин изолят Whey Isolate от Scitec Nutrition (Спортивное питание, Белок, Protein, вей, скайтек нутришн) 2000 гр, 80 порций. Бесплатная доставка от 3000 рублей, на меньшую сумму

au.ru/u-Fitness+Formula/sport/ — спортивное питание и аксессуары по самым лучшим ценам в Красноярске (удобно пользоваться поиском, например «протеин», «BCAA», «жиросжигатель» и т.д.).

Условие: Скидывайте ссылки на конкурентов (крупные сети\продавцов 24ау) в личку! Товар у конкурента должен быть в наличии!

Whey Isolate от Scitec Nutrition

Формула 100% Whey Isolate Scitec Nutrition была разработана для двух основных целей: обеспечение максимально возможной концентрации чистого белка в ароматизированной смеси и достижение наиболее значительного притока мышечных аминокислот и, следовательно, увеличение анаболического синтеза белка. Специальные источники белка в 100% Whey Isolate – это уникальные аминокислоты и сывороточные пептиды, активизирующие кровоток в мышцах. В 100% Whey Isolate низкое содержание лактозы, жиров и углеводов.

Для приготовления коктейля вам не понадобится ни блендер, ни шейкер. Whey Isolate можно просто перемешать ложкой.

Рекомендации по применению:

100% Whey Isolate может быть использован совместно с любой едой для увеличения содержания белка, во время диеты, перед сном и т. д., в зависимости от вашей потребности в питании и мышечной массы. Употребляйте 1-4 порций Whey Isolate в день.

2000 г
Порция — 25 г
Количество порций — 80
Энергетическая ценность 99 Ккал
в т.ч калории из жиров 9 Ккал
Всего жиров 1 г
Насыщенные жиры 1 г
Белки 20 г
Углеводы 2 г
в т.ч сахар 1 г
Холестерин 22 мг
Калий 172 мг
Натрий 55 мг
L-глютамин 250 мг
Ингредиенты:
тангенциальный микроультрафильтрованый сывороточный протеин содержащий бета-лактоглобулин, альфа-лактальбумин, бычий сывороточный
альбумин, иммуноглобулин, лактоферрин, гликомакропептиды, белковые микрофракции), „Amino Shuttle 1” (L-глютамин), аспартам*, ацесульфам калия, природные и искусственные
ароматизаторы (малины, шоколада, ванили, клубники, банана). * Фенилкетонурикс: содержит фенилаланин

Протеин для веганов и вегетарианцев: какой лучше употреблять

Вегетарианцы, как и веганы (люди, придерживающиеся ещё более строгого режима питания) не употребляют мяса, однако в отличие от последних, используют молочные продукты. Источником белков для представителей первой группы становятся творог и сметана, а для веганов – бобы, соя, орехи и чечевица. В этой статье рассказано более подробно о естественных источниках белка для приверженцев вегетарианского питания.

Главный недостаток растительной пищи – отсутствие креатина и некоторых других незаменимых аминокислот, содержащихся в продуктах животного происхождения. По этой причине спортсмены двух вышеназванных групп вынуждены пить протеиновые коктейли. В зависимости от интенсивности тренировок в день рекомендуется употребление 1,1-2,2 г белка на 1 кг веса спортсмена.

Протеин для вегетарианцев

Вегетарианцам подходит прием сывороточного протеина и соевого изолята, содержащего до 90% белка. Их рекомендуется смешивать с молоком и использовать до и после тренировки. В число других рекомендуемых добавок входят казеин, яичный белок, моногидрат креатина и комплекс BCAA.

Сывороточный

Это лучший протеин для вегетарианцев. Включает комплекс BCAA. Изготавливается из молочной сыворотки, отличается самой высокой скоростью усвоения. Рекомендуется принимать после тренировок.

Выпускается в форме изолята и концентрата:

• Концентрат получают путем выделения из молока жидкой сыворотки с ее последующим высушиванием (до порошка).

• Изолят получают при фильтрации сыворотки с удалением лактозы, жира и холестерина.

Яичный

Яичный протеин содержит необходимый набор аминокислот, легко усваивается, может использоваться как заменитель сывороточного протеина, однако стоит дороже. Показан при непереносимости молочных и соевых продуктов. Представляет высушенную форму (порошок) белка куриного яйца. Скорость переваривания умеренная.

Казеин

Получают путем ферментативного створаживания молока. Характеризуется низкой скоростью переваривания (до 6 часов), рекомендуется к употреблению между тренировками.

Протеин для веганов

В качестве пищевых добавок для веганов подойдут соевый изолят (или натуральные соевые продукты – тофа, темпе, эдамам), протеин, изготовленный на основе другого растительного белка, креатина моногидрат, комплекс BCAA и витаминно-минеральные комплексы.

Протеин для веганов или «protein vegan» под зонтичным брендом vplab (вплаб или VP laboratory) имеет хорошую репутацию у бодибилдеров.

Веганские протеины представляют собой пищевые добавки, изготовленные на основе богатых аминокислотами растений и их плодов.

Гороховый

Отличается легким усвоением и значительным процентом незаменимых аминокислот. В состав 28 г протеина входит 21 г белка. Энергетическая ценность порции – 100 калорий.

Продукт отличается низким содержанием метионина. Богат комплексом BCAA и лизином. Считается, что сывороточный и гороховый белок взаимозаменяемы и их действие похоже при применении в сходных условиях.

Конопляный

Получают из семян конопли. Содержит необходимый набор аминокислот. 28 г продукта (108 калорий) включают 12 г белка, клетчатку, Fe, Zn, Mg, α-линоленовую кислоту и 3-ω-жиры.

Недостаток протеина – низкое содержание лизина. Для его восполнения необходимо также употреблять в пищу бобовые культуры.

Из тыквенных семечек

В 28 г порошка (103 калории) входит 18 г белка, Fe, Zn, Mg. Беден треонином и лизином. Компоненты обладают антиоксидантной и противовоспалительной активностью.

Из коричневого риса

Легко усваивается, содержит высокий, но неполный, процент незаменимых аминокислот. Богат антиоксидантами. В 28 г порошка (107 калорий) входит 22 г белка. Беден лизином, но содержит высокий процент метионина и BCAA, что позволяет использовать его, чтобы похудеть и одновременно нарастить мышечную массу, как и сывороточный протеин.

Соевый

Содержит полный спектр аминокислот, микроэлементы и витамины. Богат BCAA. Используется как элемент спортивного питания в качестве заменителя сывороточного или яичного протеина. Имеет форму порошка. В 28 г порции (95 калорий) сдержится 22 г белка. Употребление этой добавки способствует снижению уровня холестерина в крови.

Из семян подсолнечника

Подсолнечный протеин – инновационный продукт в вегетарианском и веганском меню. 28 г протеина подсолнечника (91 калория) содержат 13 г белка, богатого BCAA. Продукт беден лизином, поэтому его часто сочетают с белком киноа.

Инка Инчи

Получают из семян (орехов) одноименного растения. 28 г (120 калорий) содержат 17 г белка. Содержит в больших количествах все незаменимые аминокислоты за исключением лизина. Богат аргинином, α-линоленовой кислотой и 3-ω-жирами.

Чиа (шалфея испанского)

В 28 г порошка (50 калорий) входит 10 г бедного лизином белка, 8 г клетчатки, биотин и Cr.

Растительные белковые смеси

Часто используются в связи с тем, что растительные протеины по отдельности содержат не все незаменимые аминокислоты. Так, белок коричневого риса часто комбинируют с протеином чиа или гороха, чтобы избежать аминокислотного дефицита. В смеси часто добавляют ароматизаторы, подсластители и ферменты для их лучшего усвоения.

Оцените материал

Научный консультант проекта. Физиолог (биологический факультет СПБГУ, бакалавриат). Биохимик (биологический факультет СПБГУ, магистратура). Инструктор по хатха-йоге (Институт управления развитием человеческих ресурсов, проект GENERATION YOGA). Научный сотрудник (2013-2015 НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Отта, работа с маркерами женского бесплодия, анализ биологических образцов; 2015-2017 НИИ особо чистых биопрепаратов, разработка лекарственных средств) Автор и научный консультант сайтов по тематике ЗОЖ и науке (в области продления жизни) C 2019 года научный консультант проекта Cross.Expert.

Редакция cross.expert

Amazon.com: Добавки для стали Veg-PRO | Веганский протеиновый порошок, Snickerdoodle | 25 порций (1,65 фунта) | Органический протеиновый порошок с аминокислотой BCAA | Без глютена | Немолочные | Формула с низким содержанием углеводов

Описание	WHEY-ISO изготовлен из 24 г чистого изолята сывороточного протеина. WHEY ISO проходит тройную фильтрацию, чтобы гарантировать чистоту без глютена, лактозы, наполнителей и любых других примесей. Самый чистый из доступных порошков сывороточного протеина для максимального роста мышц.	WHEY-PRO обогащен 24 г сывороточного протеина на мерную ложку, наполненную витаминами, минералами и питательными веществами, чтобы помочь вам в достижении ваших целей; и всегда без глютена, наполнителей и других примесей.	VEG-PRO — это веганский протеин, не содержащий ГМО, содержащий 20 г безмолочного протеина с полным профилем незаменимых аминокислот. VEG-PRO производится при низких температурах без добавления наполнителей, что обеспечивает сохранение его полного аминокислотного профиля.	Ключевые ингредиенты, клинически дозированные для максимальной эффективности	Изолят сывороточного протеина, натуральные и искусственные ароматизаторы, ксантановый пистолет, соевый лецитин, ацесульфам калий, подсолнечный (немолочный) сливки, какао (обработанное щелочью), сукралоза, лактаза, папаин	Изолят сывороточного протеина, концентрат сывороточного протеина, гидролизат сывороточного протеина, натуральные и искусственные ароматизаторы, ксантановый пистолет, соевый лецитин, ацесульфам калия, подсолнечник (немолочные сливки), какао (обработанное щелочью), сукралоза, лактаза, папаин	Белок коричневого риса, арахисовая мука, изолят горохового протеина, D-рибоза, мальтодекстрин, экстракт корня свеклы, натуральные ароматизаторы, ксантановая камедь, экстракт стевии (95% стевиолгликозидов), сукралоза, диоксид кремния.	Доступные вкусы	Шоколадное, ванильное мороженое	Французская ваниль, шоколад, клубничный чизкейк, Snickerdoodle	Арахисовое масло, ванильный кремовый пирог, шоколад, клубничный чизкейк, Snickerdoodle

Amazon.com: Steel Supplements Veg-PRO Vegan Protein Powder, арахисовое масло — порошок органического горохового протеина, без глютена, без молочных продуктов, без сои, без ГМО, аминокислота BCAA (25 порций, 1.65 фунтов): Здоровье и дом

Описание	WHEY-ISO изготовлен из 24 г чистого изолята сывороточного протеина. WHEY ISO проходит тройную фильтрацию, чтобы гарантировать чистоту без глютена, лактозы, наполнителей и любых других примесей. Самый чистый из доступных порошков сывороточного протеина для максимального роста мышц.	WHEY-PRO обогащен 24 г сывороточного протеина на мерную ложку, наполненную витаминами, минералами и питательными веществами, чтобы помочь вам в достижении ваших целей; и всегда без глютена, наполнителей и других примесей.	VEG-PRO — это веганский протеин, не содержащий ГМО, содержащий 20 г безмолочного протеина с полным профилем незаменимых аминокислот. VEG-PRO производится при низких температурах без добавления наполнителей, что обеспечивает сохранение его полного аминокислотного профиля.	Ключевые ингредиенты, клинически дозированные для максимальной эффективности	Изолят сывороточного протеина, натуральные и искусственные ароматизаторы, ксантановый пистолет, соевый лецитин, ацесульфам калий, подсолнечный (немолочный) сливки, какао (обработанное щелочью), сукралоза, лактаза, папаин	Изолят сывороточного протеина, концентрат сывороточного протеина, гидролизат сывороточного протеина, натуральные и искусственные ароматизаторы, ксантановый пистолет, соевый лецитин, ацесульфам калия, подсолнечник (немолочные сливки), какао (обработанное щелочью), сукралоза, лактаза, папаин	Белок коричневого риса, арахисовая мука, изолят горохового протеина, D-рибоза, мальтодекстрин, экстракт корня свеклы, натуральные ароматизаторы, ксантановая камедь, экстракт стевии (95% стевиолгликозидов), сукралоза, диоксид кремния.	Доступные вкусы	Шоколадное, ванильное мороженое	Французская ваниль, шоколад, клубничный чизкейк, Snickerdoodle	Арахисовое масло, ванильный кремовый пирог, шоколад, клубничный чизкейк, Snickerdoodle

(PDF) Влияние тренировок с отягощениями и добавок протеина и аминокислот на анаболизм, массу и силу мышц

(за исключением 10 минут разминки и заминки), и все занятия проводились под контролем главного исследователя. и = или обученный аспирант

человек.Формат и относительная интенсивность тренировочного протокола в

включали 3 подхода по 6–8 повторений с 85–90% 1-RM. Участникам было снижено

отдыха на 180 секунд между подходами и упражнениями, поскольку это представляло соответствующее соотношение работа: отдых (1: 5) для данной интенсивности упражнений

(Baechle et al.,

2000). Пропущенные тренировки были компенсированы в альтернативный день и

таким образом, чтобы между занятиями существовали стандартные 48 часов, чтобы обеспечить

адекватное восстановление и восстановление между занятиями.Субъекты были информированы о том, что отсутствие трех тренировочных сессий приведет к дисквалификации

из исследования. В дополнение к предтренировочному 1-RM для PLC и PRO,

1-RM был оценен после 4 и 8 недель для всех тренировочных упражнений, так что

можно было внести любые необходимые корректировки в соответствии с увеличением силы

, тем самым гарантируя, что испытуемые продолжали тренироваться с относительной интенсивностью

, составляющей 85–90% от их 1-RM.

Протокол приема добавок

На каждой тренировке участникам давали их соответствующую добавку

, смешанную с 500 мл воды за 1 час до и сразу после тренировки

.Группа PLC получила всего 40 г декстрозы,

, тогда как группа PRO получила всего 40 г белка [28 г белка

(14 г концентрата сывороточного белка, 6 г изолята сывороточного белка, 4 г молочного протеина).

изолят теина, 4 г казеината кальция) и 12 г свободных аминокислот (0,22 г

аргинина, 0,22 г гистидина, 0,14 г изолейцина, 6,0 г лейцина, 0,44 г лизина,

0,44 г метионина, 0,20 г фенилаланина, и 0,22 г валина, 0,12 г аспара-

тата, 2.0 г глутамина и 2,0 г тирозина)]. Обе добавки были изо-

калорий и были независимо приготовлены в индивидуально закрытых упаковках

(FSI Nutrition, Омаха, Северная Каролина, США). В дни без упражнений 40 г

PLC или PRO принималось утром после пробуждения. Участникам

было предоставлено необходимое количество пакетов с добавками на

дней без упражнений на еженедельной основе, и они возвращали пустые пакеты по номеру

в конце каждой недели, чтобы обеспечить соблюдение требований.

Диетические записи

Диеты испытуемых не были стандартизированы, и испытуемых просили

не изменять свои диетические привычки в ходе исследования. Однако

субъектов должны были вести записи о питании в течение 7 дней в течение недели, предшествующей

до начала протокола тренировок и приема добавок, а также в течение

недель 5 и 10. Отзывы о питании оценивались с помощью кухонного комбайна

. программное обеспечение (ESHA Research, Салем, Орегон, США)

для определения среднего ежедневного потребления макроэлементов жира, углеводов

гидратов и белков с пищей.

Выделение тотальной РНК скелетных мышц

Общую клеточную РНК экстрагировали из образцов биопсии с монофазным раствором

фенола и гуанидин изотиоцианата (Chomczynski и

Sacchi, 1987), содержащимся в TRI-реагенте (Sigma Chemical Co.,

).

Сент-Луис, Миссури). Затем аликвоты общей РНК разделяли электрофорезом в агарозном геле

и контролировали в ультрафиолетовом свете (Chemi-Doc

XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) для проверки целостности РНК и отсутствия деградации РНК

, на что указывает заметная 28s и 18s рибосомные полосы РНК

(данные не показаны), а также отношение OD

260

= OD

280

примерно

2.0 (Current Protocols in Molecular Biology, 1999; Willoughby, 2004a, b;

Willoughby and Nelson, 2002; Willoughby and Rosene, 2001). Мы наблюдали, что

служили средним отношением (SD), равным 1,93 (0,03) для всех образцов. Образцы РНК

хранились при 80



° C до последующего анализа.

Обратная транскрипция и синтез кДНК

Два микрограмма общей РНК скелетных мышц были подвергнуты обратной транскрипции для синтеза кДНК

с использованием набора iSscript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Her-

cules, CA, USA).Каждую реакционную смесь обратной транскрипции инкубировали

при 25

° C в течение 5 мин, 42



° C в течение 30 минут, нагревали до 85



° C в течение 10 минут, а затем быстро охлаждали

лед. Концентрацию кДНК определяли с использованием

OD

260

, эквивалентного 50 мг = мл (Current Protocols in Molecular Biology,

1999), и исходную концентрацию матрицы кДНК стандартизировали с помощью ad-

, просто отбирая все образцы для 200 нг до амплификации (Willoughby, 2004a, b).

Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР

Последовательности мРНК β-актина скелетных мышц человека (NM_001101),

MHC типа I (AC X06976), MHC типа IIa (AF111784), MHC типа IIx

(AF111785), IGF- 1Ea (NM_000618) и b-актин (NM_001101), опубликованные в базе данных NCBI Entrez Nucleotide (www.ncdi.nlm.hih.gov)

, были использованы для конструирования праймеров для ПЦР с использованием программного обеспечения Beacon Designer (Bio-

Rad, Hercules, CA, USA), а затем коммерчески синтезировали (Integrated

DNA Technologies, Coralville, IA).Эти праймеры амплифицируют фрагменты длиной

,

, 141, 145 и 148 п.н. соответственно для типов I, IIa, IIx MHC и 150 п.н.

для IGF-1. Поскольку он рассматривается как конститутивно выраженный «домашний

хранящий ген», а также тот факт, что он оказался подходящим внешним эталонным стандартом

в ПЦР в реальном времени, β-актин был использован для обнаружения:

— относительное изменение количества мРНК (Mahoney et al., 2004).

Для b-актина эти праймеры амплифицируют фрагмент ПЦР длиной 135 п.н.Кроме того, мы наблюдали, что b-actin претерпевает лишь небольшое количество вариаций

в экспрессии от одной точки отбора проб к другой. Общее среднее отклонение

между двумя образцами мышц составило 2,25%, что дает

дополнительных доказательств, позволяющих предположить, что β-актин является подходящим внешним контролем.

ПЦР-амплификация и количественный анализ в реальном времени

Двести нанограммов кДНК-матрицы были добавлены в iQ SYBR

Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, США), и каждая реакция ПЦР

была амплифицирована с использованием количественного анализа в реальном времени. ПЦР (iCycler IQ Real-Time

PCR Detection System, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).Профиль амплификации

выполнялся в течение 40 циклов, используя этап денатурации при 95

° C в течение

30 секунд, отжиг праймера при 58



° C в течение 30 секунд и удлинение при 72



C для

30 сек. Флуоресценцию измеряли после каждого цикла в результате включения

зеленого красителя SYBR в каждый ампликон. Количество мРНК

определяли относительно экспрессии β-актина, и значения C

T

использовали для сравнения экспрессии генов до и после протоколов тренировки сопротивления

и добавок.Специфичность ПЦР

была продемонстрирована с помощью реакции абсолютного отрицательного контроля, содержащей

без матрицы кДНК, а единичный генный продукт был подтвержден с помощью анализа кривой плавления ДНК

. Положительная амплификация ампликонов была оценена

с помощью электрофореза в агарозном геле с просвечиванием УФ-трансиллюминацией

(Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) (данные не показаны).

Количественное определение миофибриллярного белка

Общий белок, оставшийся после процедуры выделения тотальной РНК, составлял

, выделенный с изопропанолом, этанолом и 0.3 М гуанидин гидрохлорид.

Миофибриллярный белок дополнительно выделяли с помощью повторных инкубаций в

0,1% SDS при 50



° C и разделяли центрифугированием. Содержание миофибриллярного белка

определяли спектрофотометрически по методу Брэдфорда

при длине волны 595 нм (Bradford, 1976). Стандартная кривая

была построена (r

2

0,98, p 0,001) с использованием бычьего сывороточного альбумина (Bio-

Rad, Hercules, Калифорния), и миофибриллярный белок был определен количественно относительно сырой массы мышцы

( Уиллоуби и Нельсон, 2002; Уиллоуби, 2004b).

Количественное определение изоформ белка MHC

Используя принципы SDS-PAGE и LabChip (Caliper Life Sciences,

Hopkinton, MA), состав изоформ белка MHC

в гомогенатах мышц 20 мг был определен при денатурирующем кон-

измерений с использованием автоматической системы электрофореза Experion Pro260

(Bio-Rad, Hercules, CA). Набор для анализа Experion Pro260 имеет разрешение и количественное определение 10–260 кДа белков, а также разделяет и обнаруживает

2.5–2000 нг = мл белка. Система Experion Pro260 сочетает в себе

Упражнения с отягощениями и протеиновые добавки

Протеомная оценка воспалительных белков в интерстициальной жидкости и лимфе селезенки крыс во время системного воспаления, вызванного ЛПС, выявила повышенные уровни ADAMST1

Селезенка является частью иммунной системы и участвует в реакции на системное воспаление, вызванное патогенами, передающимися с кровью, которые могут вызывать сепсис.Знание белкового состава микросреды селезенки в контрольной ситуации и во время системного воспаления может способствовать нашему пониманию патофизиологии сепсиса. Насколько нам известно, протеом жидкой фазы микросреды селезенки ранее не исследовался. Чтобы получить доступ к проксимальной жидкости, окружающей клетки селезенки, мы собрали постузловую эфферентную лимфу селезенки у крыс с помощью канюляции и интерстициальную жидкость селезенки (IF) с помощью центрифугирования.Происхождение изолированного IF селезенки оценивали с помощью внеклеточного индикатора (51) Cr-EDTA и плазменного индикатора (125) I-HSA. Образцы лимфы селезенки, IF и плазмы были собраны во время индуцированного липополисахаридом (LPS) системного воспаления и проанализированы с использованием цитокинового мультиплексного анализа и, впервые, с использованием протеомики на основе масс-спектрометрии без метки. Концентрации TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-10 увеличивались в несколько раз во всех жидкостях после воздействия LPS. В общей сложности 281, 201 и 236 белков были идентифицированы в лимфе, IF и плазме соответственно, и некоторые из них были обнаружены только после LPS.Дезинтегрин и металлопротеиназа с тромбоспондиновыми мотивами 1 (ADAMTS1) была обнаружена протеомикой (про-регион) в лимфе только после ЛПС. ADAMTS1 оценивали с помощью ELISA (домен металлопротеиназы), и концентрация была значительно выше в IF и лимфе, чем в плазме в контрольной ситуации, показывая местную продукцию в селезенке. Резкое увеличение ADAMTS1 было обнаружено в лимфе, IF и плазме после воздействия LPS. В заключение, процедуры, которые мы использовали для выделения IF и лимфы из селезенки во время LPS, позволили выявить локально продуцируемые белки.Кроме того, мы продемонстрировали, что воспалительный протеом в микросреде селезенки отличается от протеома в плазме.

Синтетическое поверхностно-активное вещество с аналогом рекомбинантного поверхностно-активного протеина С улучшает функцию легких и ослабляет воспаление на модели острого респираторного дистресс-синдрома у взрослых кроликов | Респираторные исследования

1.

Острый респираторный дистресс-синдром N, Брауэр Р.Г., Маттей М.А., Моррис А., Шонфельд Д., Томпсон Б.Т. и др.Вентиляция с меньшими дыхательными объемами по сравнению с традиционными дыхательными объемами при остром повреждении легких и остром респираторном дистресс-синдроме. N Engl J Med. 2000. 342 (18): 1301–8.

Артикул Google ученый

2.

Хайцма Дж., Лахманн Р.А., Лахманн Б. Защитная вентиляция легких при ОРДС: роль медиаторов, ПДКВ и сурфактанта. Сундук Monaldi Arch Dis. 2003. 59 (2): 108–18.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

3.

Wong JJ, Jit M, Sultana R, Mok YH, Yeo JG, Koh J, et al. Смертность при педиатрическом остром респираторном дистресс-синдроме: систематический обзор и метаанализ. J Intensive Care Med. 2019; 34 (7): 563–71 Epub 2017/05/04.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

4.

Орлов К.Е., Тернер Д.А., Редер К.Дж. Современное состояние педиатрического острого респираторного дистресс-синдрома. Педиатр Аллергия Иммунол Пульмонол. 2019; 32 (2): 35–44 Epub 2019/06/27.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

5.

Villar J, Sulemanji D, Kacmarek RM. Синдром острого респираторного дистресс-синдрома: заболеваемость и смертность, изменились ли? Curr Opin Crit Care. 2014; 20 (1): 3–9.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

6.

Force ADT, Раньери В.М., Рубенфельд Г.Д., Томпсон Б.Т., Фергюсон Н.Д., Колдуэлл Э. и др.Синдром острого респираторного дистресс-синдрома: берлинское определение. ДЖАМА. 2012. 307 (23): 2526–33.

Google ученый

7.

Душиантан А., Кьюсак Р., Госс В., Постл А.Д., Грокотт М.П. Клинический обзор: терапия экзогенными сурфактантами при остром повреждении легких / остром респираторном дистресс-синдроме — что нам делать дальше? Crit Care. 2012; 16 (6): 238.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

8.

Autilio C, Perez-Gil J. Понимание основных биофизических концепций легочного сурфактанта в здоровье и болезнях. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2019; 104 (4): F443 – F51 Epub 2018/12/16.

PubMed PubMed Central Google ученый

9.

Matthay MA, Zemans RL. Синдром острого респираторного дистресс-синдрома: патогенез и лечение. Анну Рев Патол. 2011; 6: 147–63.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

10.

Verbrugge SJ, Sorm V, Lachmann B. Механизмы острого респираторного дистресс-синдрома: роль сурфактантных изменений и механическая вентиляция. J. Physiol Pharmacol. 1997. 48 (4): 537–57.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

11.

Земанс Р.Л., Колган С.П., Дауни Г.П. Трансэпителиальная миграция нейтрофилов: механизмы и последствия острого повреждения легких. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009. 40 (5): 519–35.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

12.

Pierrakos C, Karanikolas M, Scolletta S, Karamouzos V, Velissaris D. Острый респираторный дистресс-синдром: патофизиология и варианты лечения. J Clin Med Res. 2012; 4 (1): 7–16.

PubMed PubMed Central Google ученый

13.

Bos LDJ, Scicluna BP, Ong DSY, Cremer O, van der Poll T, Schultz MJ. Понимание гетерогенности биологических фенотипов синдрома острого респираторного дистресса по профилям экспрессии лейкоцитов.Am J Respir Crit Care Med. 2019; 200 (1): 42–50 Epub 2019.01.16.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

14.

Reilly JP, Calfee CS, Christie JD. Фенотипы синдрома острого респираторного дистресс-синдрома. Semin Respir Crit Care Med. 2019; 40 (1): 19–30 Epub 2019/05/07.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

15.

Bos LD, Schouten LR, van Vught LA, Wiewel MA, Ong DSY, Cremer O, et al.Идентификация и подтверждение различных биологических фенотипов у пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом с помощью кластерного анализа. Грудная клетка. 2017; 72 (10): 876–83 Epub 2017/04/30.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

16.

Де Лука Д. Индивидуальная помощь при остром респираторном дистресс-синдроме в соответствии с возрастом пациентов. Ланцет Респир Мед. 2019; 7 (2): 100–1 Epub 2018/10/27.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

17.

Де Лука Д., Харрисон Д.А., Питерс М.Дж. «Комкование или расщепление» при остром респираторном дистресс-синдроме у детей (PARDS). Intensive Care Med. 2018; 44 (9): 1548–50 Epub 2018/08/26.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

18.

Guerin C, Reignier J, Richard JC, Beuret P, Gacouin A, Boulain T, et al. Положение лежа на животе при тяжелом остром респираторном дистресс-синдроме. N Engl J Med. 2013. 368 (23): 2159–68.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

19.

Слуцкий А.С., Раньери ВМ. Повреждение легких, вызванное искусственной вентиляцией легких. N Engl J Med. 2013. 369 (22): 2126–36.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

20.

Анзуэто А., Боуман Р.П., Гунтупалли К.К., Вег Дж. Г., Видеманн Х.П., Равентос А.А. и др. Сурфактант в аэрозольной форме у взрослых с острым респираторным дистресс-синдромом, вызванным сепсисом. Exosurf Группа изучения острого респираторного дистресс-синдрома, сепсиса. N Engl J Med. 1996. 334 (22): 1417–21.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

21.

Грегори Т.Дж., Стейнберг К.П., Спрагг Р., Гадек Дж. Э., Хайерс ТМ, Лонгмор В. Дж. И др. Терапия сурфактантом крупного рогатого скота для пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом. Am J Respir Crit Care Med. 1997. 155 (4): 1309–15.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

22.

Kesecioglu J, Beale R, Stewart TE, Findlay GP, Rouby JJ, Holzapfel L, et al. Экзогенный природный сурфактант для лечения острого повреждения легких и острого респираторного дистресс-синдрома. Am J Respir Crit Care Med. 2009. 180 (10): 989–94.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

23.

Маркарт П., Рупперт С., Выгрека М., Коларис Т., Дахал Б., Уолмрат Д. и др. Пациенты с ОРДС демонстрируют улучшение, но не нормализацию активности альвеолярной поверхности при лечении сурфактантом: предполагаемая роль нейтральных липидов.Грудная клетка. 2007. 62 (7): 588–94.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

24.

Spragg RG, Lewis JF, Walmrath HD, Johannigman J, Bellingan G, Laterre PF, et al. Влияние рекомбинантного сурфактанта на основе сурфактанта протеина С на острый респираторный дистресс-синдром. N Engl J Med. 2004. 351 (9): 884–92.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

25.

Spragg RG, Lewis JF, Wurst W., Hafner D, Baughman RP, Wewers MD, et al. Лечение острого респираторного дистресс-синдрома рекомбинантным сурфактантом протеина С. Am J Respir Crit Care Med. 2003. 167 (11): 1562–6.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

26.

Spragg RG, Taut FJ, Lewis JF, Schenk P, Ruppert C, Dean N, et al. Рекомбинантный сурфактант на основе сурфактанта протеина С для пациентов с тяжелым прямым повреждением легких.Am J Respir Crit Care Med. 2011. 183 (8): 1055–61.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

27.

Weg JG, Balk RA, Tharratt RS, Jenkinson SG, Shah JB, Zaccardelli D, et al. Безопасность и потенциальная эффективность аэрозольного сурфактанта при респираторном дистресс-синдроме у взрослых, вызванном сепсисом. ДЖАМА. 1994. 272 ​​(18): 1433–8.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

28.

Meng H, Sun Y, Lu J, Fu S, Meng Z, Scott M и др. Экзогенный сурфактант может улучшить оксигенацию, но не снизить смертность взрослых пациентов с острым повреждением легких / острым респираторным дистресс-синдромом: метаанализ 9 клинических испытаний. J Cardiothorac Vasc Anesth. 2012; 26 (5): 849–56.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

29.

Seehase M, Collins JJ, Kuypers E, Jellema RK, Ophelders DR, Ospina OL, et al.Новое поверхностно-активное вещество с аналогами SP-B и C дает преимущество в выживаемости после инактивации у недоношенных ягнят. PLoS One. 2012; 7 (10): e47631.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

30.

Calkovska A, Linderholm B, Haegerstrand-Bjorkman M, Pioselli B, Pelizzi N, Johansson J, et al. Состав фосфолипидов в синтетических поверхностно-активных веществах важен для дыхательных объемов и стабильности альвеол у недоношенных кроликов, получавших сурфактант.Неонатология. 2016; 109 (3): 177–85 Epub 2016/01/13.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

31.

Дэвис А.Дж., Джоб А.Х., Хафнер Д., Икегами М. Функция легких у недоношенных ягнят и кроликов, обработанных рекомбинантным поверхностно-активным веществом SP-C. Am J Respir Crit Care Med. 1998. 157 (2): 553–559.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

32.

Hafner D, Germann PG, Hauschke D. Сравнение сурфактанта rSP-C с натуральными и синтетическими сурфактантами после позднего лечения на крысиной модели острого респираторного дистресс-синдрома. Br J Pharmacol. 1998. 124 (6): 1083–90.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

33.

Willander H, Askarieh G, Landreh M, Westermark P, Nordling K, Keranen H, et al. Структура домена BRICHOS с высоким разрешением и ее значение для активности антиамилоидного шаперона в отношении легочного сурфактантного белка C.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2012; 109 (7): 2325–9.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

34.

Hosia W, Johansson J, Griffiths WJ. Обмен водорода / дейтерия и агрегация поливалина и альфа-спирали полилейцина исследованы с помощью матричной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией и ионизацией. Протеомика клеток Mol. 2002; 1 (8): 592–7.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

35.

Kallberg Y, Gustafsson M, Persson B, Thyberg J, Johansson J. Прогнозирование белков, образующих амилоидные фибриллы. J Biol Chem. 2001. 276 (16): 12945–50.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

36.

Nilsson G, Gustafsson M, Vandenbussche G, Veldhuizen E, Griffiths WJ, Sjovall J, et al. Синтетические пептидсодержащие поверхностно-активные вещества — оценка трансмембранных по сравнению с амфипатическими спиралями и замещения поли-валила поверхностно-активного протеина С на поли-лейцил.Eur J Biochem. 1998. 255 (1): 116–24.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

37.

Йоханссон Дж., Кёрстедт Т. Синтетические поверхностно-активные вещества с аналогами SP-B и SP-C для обеспечения возможности лечения во всем мире респираторного дистресс-синдрома новорожденных и других заболеваний легких. J Intern Med. 2018; 285 (2): 165–86.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

38.

Johansson J, Some M, Linderholm BM, Almlen A, Curstedt T., Robertson B. Синтетическое поверхностно-активное вещество на основе аналога поли-Leu SP-C и фосфолипидов: влияние на дыхательные объемы и объемы легочного газа у незрелых новорожденных кроликов, находящихся на вентиляции легких. J Appl Physiol. 1985. 95 (5): 2055–63.

Артикул Google ученый

39.

Curstedt T, Calkovska A, Johansson J. Синтетические поверхностно-активные вещества нового поколения. Неонатология. 2013. 103 (4): 327–30.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

40.

Кронквист Н., Сарр М., Линдквист А., Нордлинг К., Отиковс М., Вентури Л. и др. Эффективное производство белка, вдохновленное тем, как пауки производят шелк. Nat Commun. 2017; 8: 15504.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

41.

Гибсон-Корли К.Н., Оливье А.К., Мейерхольц Д.К. Принципы действительной гистопатологической оценки в исследованиях. Vet Pathol. 2013; 50 (6): 1007–15 Epub 2013/04/06.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

42.

Вильяр Дж., Белда Дж., Анон Дж. М., Бланко Дж., Перес-Мендес Л., Феррандо С. и др. Оценка эффективности дексаметазона в лечении пациентов со стойким острым респираторным дистресс-синдромом: протокол рандомизированного контролируемого исследования. Испытания. 2016; 17: 342.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

43.

Hite RD, Seeds MC, Jacinto RB, Grier BL, Waite BM, Bass DA. Ингибирование легочного сурфактанта лизофосфолипидами и жирными кислотами: неферментативные модели гидролиза сурфактанта фосфолипазы А2.Biochim Biophys Acta. 2005; 1720 (1-2): 14-21.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

44.

Krafft MP. Преодоление инактивации сурфактанта легких белками сыворотки: потенциальная роль фторуглеродов? Мягкая материя. 2015; 11 (30): 5982–94.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

45.

Seeds MC, Grier BL, Suckling BN, Safta AM, Long DL, Waite BM, et al.Опосредованное секреторной фосфолипазой А2 истощение фосфатидилглицерина при раннем остром респираторном дистресс-синдроме. Am J Med Sci. 2012. 343 (6): 446–51.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

46.

Галани В., Тацаки Е., Бай М., Китсулис П., Лекка М., Накос Г. и др. Роль апоптоза в патофизиологии синдрома острого респираторного дистресса (ОРДС): современный клеточно-специфический обзор. Pathol Res Pract.2010. 206 (3): 145–50.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

47.

Глумофф В., Вайринен О., Кангас Т., Холлман М. Степень зрелости легких определяет направление индуцированного интерлейкином-1 эффекта на экспрессию сурфактантных белков. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000. 22 (3): 280–8.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

48.

Ли Дж. У., Гонсалес РФ, Чапин С. Джей, Буш Дж., Файнман Дж. Р., Гутьеррес Дж. А.. Оксид азота снижает экспрессию гена сурфактантного белка в первичных культурах пневмоцитов II типа. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005. 288 (5): L950–7.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

49.

Конфалониери М., Салтон Ф., Фабиано Ф. Острый респираторный дистресс-синдром. Eur Respir Rev.2017; 26 (144): 160116.

50.

Марик П.Е., Пасторес С.М., Аннан Д., Медури Г.У., Спранг С.Л., Арлт В.и др. Рекомендации по диагностике и лечению недостаточности кортикостероидов у взрослых пациентов в критическом состоянии: согласованные заявления международной рабочей группы Американского колледжа интенсивной терапии. Crit Care Med. 2008. 36 (6): 1937–49.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

51.

Руань С.И., Линь Х.Х., Хуанг, Коннектикут, Куо Ф.Х., Ву Х.Д., Ю СиДжей.Изучение гетерогенности эффектов кортикостероидов на острый респираторный дистресс-синдром: систематический обзор и метаанализ. Crit Care. 2014; 18 (2): R63.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

52.

Валенца Ф., Гульельми М., Маффиолетти М., Тедеско С., Макканьи П., Фоссали Т. и др. Положение лежа задерживает прогрессирование вызванного вентилятором повреждения легких у крыс: играет ли роль распределение деформации легких? Crit Care Med.2005. 33 (2): 361–7.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

53.

Piedalue F, Albert RK. Положение лежа на животе при остром респираторном дистресс-синдроме. Respir Care Clin N Am. 2003. 9 (4): 495–509.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

54.

Калк П., Сенф П., Дежа М., Петерсен Б., Буш Т., Бауэр С. и др. Вдыхание антагониста рецептора эндотелина ослабляет воспаление легких при экспериментальном остром повреждении легких.Может J Physiol Pharmacol. 2008. 86 (8): 511–5.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

55.

Kamiyama J, Jesmin S, Sakuramoto H, Shimojyo N, Islam M, Hagiya K, et al. Гиперинфляция ухудшает оксигенацию артерий и повреждение легких на модели ОРДС на кроликах с повторным открытым эндотрахеальным отсасыванием. BMC Anesthesiol. 2015; 15:73.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

56.

Ricci F, Catozzi C, Murgia X, Rosa B, Amidani D, Lorenzini L и др. Физиологическая, биохимическая и биофизическая характеристика спонтанно дышащего кролика с лаважем легких как модель респираторного дистресс-синдрома. PLoS One. 2017; 12 (1): e0169190.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

57.

Лутц С.Дж., Пиконе А., Гатто Л.А., Пасканик А., Ландас С., Ниман Г.Ф. Экзогенный сурфактант и положительное давление в конце выдоха при лечении повреждения легких, вызванного эндотоксинами.Crit Care Med. 1998. 26 (8): 1379–89.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

58.

Nieman GF, Gatto LA, Paskanik AM, Yang B, Fluck R, Picone A. Замена сурфактанта в лечении индуцированного сепсисом респираторного дистресс-синдрома у взрослых свиней. Crit Care Med. 1996. 24 (6): 1025–33.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

59.

Sun B, Curstedt T, Robertson B. Экзогенное поверхностно-активное вещество улучшает эффективность вентиляции и расширение альвеол у крыс с аспирацией мекония. Am J Respir Crit Care Med. 1996. 154 (3 Pt 1): 764–70.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

60.

Цукер А.Р., Холм Б.А., Кроуфорд Г.П., Ридж К., Вуд Л.Д., Снайдер Дж. ПДКВ необходимо экзогенному сурфактанту для уменьшения отека легких при аспирационном пневмоните собак.J Appl Physiol. 1985. 73 (2): 679–86.

Артикул Google ученый

61.

Williams AE, Chambers RC. Ртутная природа нейтрофилов: все еще загадка при ОРДС? Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2014; 306 (3): L217–30.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

62.

Donnelly SC, Strieter RM, Kunkel SL, Walz A, Robertson CR, Carter DC, et al.Интерлейкин-8 и развитие респираторного дистресс-синдрома у взрослых в группах риска. Ланцет. 1993. 341 (8846): 643–7.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

63.

Альбертин К.Х., Сулье М.Ф., Ван З., Ишизака А., Хашимото С., Циммерман Г.А. и др. Fas и fas-лиганд активируются в жидкости отека легких и легочной ткани пациентов с острым повреждением легких и острым респираторным дистресс-синдромом.Am J Pathol. 2002. 161 (5): 1783–96.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

64.

Ким Д.К., Фукуда Т., Томпсон Б.Т., Кокрил Б., Хейлз С., Бонвентре СП. Активность фосфолипазы А2 в жидкости бронхоальвеолярного лаважа повышается при респираторном дистресс-синдроме у взрослых людей. Am J Phys. 1995; 269 (1, часть 1): L109–18 Epub 1995/07/01.

CAS Google ученый

65.

Touqui L, Arbibe L. Роль фосфолипазы A2 в патогенезе ОРДС. Мол Мед сегодня. 1999; 5 (6): 244–9 Epub 1999/06/15.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

66.

Де Лука Д., Лопес-Родригес Э., Минуччи А., Вендиттелли Ф., Джентиле Л., Стивал Э и др. Клиническая и биологическая роль секреторной фосфолипазы A2 у младенцев с острым респираторным дистресс-синдромом. Crit Care. 2013; 17 (4): R163 Epub 2013/07/26.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

67.

Taut FJ, Rippin G, Schenk P, Findlay G, Wurst W., Hafner D, et al. Поиск подгрупп пациентов с ОРДС, которым может помочь заместительная терапия сурфактантом: объединенный анализ пяти исследований с рекомбинантным сурфактантом протеин-С (Venticute). Грудь. 2008. 134 (4): 724–32.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

68.

Zuo YY, Veldhuizen RA, Neumann AW, Petersen NO, Possmayer F. Текущие перспективы легочного сурфактанта — ингибирование, усиление и оценка. Biochim Biophys Acta. 2008; 1778 (10): 1947–77.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

69.

Herting E, Rauprich P, Stichtenoth G, Walter G, Johansson J, Robertson B. Устойчивость различных препаратов поверхностно-активных веществ к инактивации меконием. Pediatr Res.2001; 50 (1): 44–9.

Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Белок репарации ДНК ALKBh3 обеспечивает устойчивость к темозоломиду в клетках глиобластомы человека | Нейроонкология

Абстрактные

Введение

Мультиформная глиобластома (GBM; степень астроцитомы IV Всемирной организации здравоохранения) является наиболее частой и наиболее злокачественной первичной опухолью головного мозга у взрослых. Несмотря на мультимодальную терапию, все такие опухоли практически рецидивируют в течение курса терапии, в результате чего средняя выживаемость составляет всего 14.6 месяцев у пациентов с впервые диагностированной ГБМ. Настоящее исследование было направлено на изучение экспрессии белка репарации ДНК AlkB, гомолог 2 (ALKBh3) в GBM человека и определение того, может ли он способствовать устойчивости к химиотерапии темозоломидом.

Методы

Экспрессию ALKBh3 в клеточных линиях GBM и в GBM человека определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и анализа экспрессии гена соответственно. Чувствительность к лекарству оценивалась в клетках GBM, сверхэкспрессирующих ALKBh3, и в клетках, в которых экспрессия ALKBh3 подавлялась малой интерферирующей (si) РНК.Экспрессию ALKBh3 после активации пути р53 исследовали с помощью вестерн-блоттинга и qRT-PCR.

Результаты

ALKBh3 обильно экспрессировалась в установленных клеточных линиях GBM и GBM человека, а воздействие темозоломида увеличивало клеточные уровни экспрессии ALKBh3. Сверхэкспрессия ALKBh3 в клеточных линиях U87 и U251 GBM усиливала устойчивость к метилирующим агентам темозоломиду и метилметансульфонату, но не к неметилирующему агенту доксорубицину. Напротив, siRNA-опосредованный нокдаун ALKBh3 увеличивает чувствительность клеток GBM к темозоломиду и метилметансульфонату, но не к доксорубицину или цисплатину.Негенотоксическая активация пути р53 селективным мышиным двойным антагонистом 2 минуты 2 нутлином-3 вызвала значительное снижение клеточных уровней транскрипции ALKBh3.

Заключение

Наши результаты идентифицируют ALKBh3 как новый медиатор устойчивости к темозоломиду в клетках GBM человека. Кроме того, мы помещаем ALKBh3 в новый клеточный контекст, демонстрируя его регуляцию с помощью пути p53.

Мультиформная глиобластома (GBM; степень астроцитомы IV Всемирной организации здравоохранения) является наиболее распространенной первичной опухолью головного мозга у взрослых.Он представляет собой высокоинвазивный, пролиферативный и агрессивный тип рака, от которого в настоящее время не существует лечения. Устойчивость к послеоперационной лучевой и химиотерапии является основной причиной неэффективности лечения у пациентов с ГБМ. Недавно было показано, что у пациентов с впервые диагностированным заболеванием добавление сопутствующей и адъювантной химиотерапии темозоломидом к послеоперационной фракционированной лучевой терапии увеличивает среднюю выживаемость, а также 2- и 5-летнюю выживаемость по сравнению с одной лучевой терапией. ^1,2 Однако в ходе терапии радио- и химиорезистентность обычно проявляется в виде местного рецидива опухоли. В результате только 1 из 4 пациентов с ГБМ выживает через 2 года после постановки диагноза, несмотря на агрессивное мультимодальное лечение. ¹ Чтобы улучшить этот плохой прогноз, крайне необходимо раскрыть молекулярную основу низкой чувствительности GBM к химиотерапии.

Темозоломид представляет собой пролекарство, спонтанно превращающееся при физиологическом pH в его активный метаболит 5- (3-метилтриазен-1-ил) имидазол-4-карбоксамид, который создает цитотоксические метильные аддукты в атомах азота и кислорода в основаниях ДНК. ³ Однако несколько независимых механизмов репарации ДНК, которые обычно защищают целостность генома, могут способствовать устойчивости к лекарствам и выживанию раковых клеток за счет удаления индуцированных химиотерапией аддуктов ДНК. Например, аддукты O ⁶ -метилгуанина являются субстратами для повсеместного белка репарации ДНК O ⁶ -метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT), тогда как часто встречающиеся аддукты N ³ -метиладенин и N ⁷ -метилгуанин являются системой эксцизионной репарации оснований в сотрудничестве с поли (АДФ-рибоза) полимеразой – 1. ^4,5 Таким образом, на противораковую эффективность темозоломида сильно влияет способность репарации клеточной ДНК. Противодействие специфическим белкам репарации ДНК в GBM может оказаться многообещающей терапевтической стратегией для повышения цитотоксичности темозоломида и продления выживаемости пациентов.

Белок репарации ДНК, гомолог 2 AlkB человека (ALKBh3), представляет собой окислительную деметилазу, способную напрямую реверсировать повреждения оснований N ¹ -метиладенин и N ³ -метилцитозин в двух- и одноцепочечной ДНК. ⁶ Хотя эти поражения считаются слабо мутагенными, они считаются высоко цитотоксичными из-за их способности нарушать репликацию ДНК. ALKBh3 экспрессируется исключительно в ядре клетки, где он локализуется в основном в фокусах репликации во время S-фазы клеточного цикла посредством взаимодействия с ядерным антигеном пролиферирующих клеток (PCNA) через мотив, взаимодействующий с ALKBh3 PCNA. ^6,7 Таким образом было высказано предположение, что ALKBh3 может играть роль в репарации ДНК вблизи репликационной вилки. ⁸ Эмбриональные фибробласты мышей с геном-мишенью, дефицитных по ALKBh3, оказались неспособными восстанавливать N ¹ -метиладенин в ДНК после обработки метилметансульфонатом. ⁹ В результате клетки с дефицитом ALKBh3 были более чувствительны к воздействию метилметансульфоната, чем клетки дикого типа (wt), что указывает на то, что ALKBh3 играет функционально важную роль в клеточной защите от метилирующих агентов. Поскольку считается, что N ¹ -метиладенин и N ³ -метилцитозин индуцируются преимущественно во время S-фазы клеточного цикла, можно ожидать, что цитотоксический эффект этих поражений будет значительным, если их не исправить в быстро пролиферирующих клетках, таких как раковые клетки.Однако в настоящее время неизвестно, в какой степени ALKBh3 экспрессируется в клетках GBM и GBM человека и может ли он способствовать развитию устойчивости к клинически сильному лекарственному средству темозоломиду.

В этой работе мы сообщаем, что ALKBh3 высоко экспрессируется в клетках GBM и GBM человека по сравнению с неопухолевым человеческим мозгом (NHB), и что воздействие темозоломида может дополнительно повышать уровни транскрипции ALKBh3. Более того, мы показываем, что сверхэкспрессия ALKBh3 увеличивает устойчивость клеток к темозоломиду и метилметансульфонату, но не влияет на чувствительность клеток к неметилирующим агентам.Мы показываем, что подавление активности ALKBh3 увеличивает клеточную чувствительность как к темозоломиду, так и к метилметансульфонату, предполагая, что высокий уровень экспрессии ALKBh3 может быть важным медиатором химиорезистентности в GBM человека. Мы также показываем, что негенотоксическая активация пути p53 приводит к существенному подавлению активности ALKBh3 как на уровне мРНК, так и на уровне белка в клетках GBM.

Материалы и методы

Культура клеток и реагенты

Клеточные линии GBM человека A172 (Массачусетский технологический институт), CCF-STTG1 (Фонд кливлендской клиники), D37 (Медицинский центр Университета Дьюка), GaMg (Университет Бергена), HF66 (больница Генри Форда), LN18, LN229 (центр Hospitalier Universitaire Vaudois, Швейцария), T98 (Стэнфордский университет), U87, U118 и U251 (Университет Упсалы) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Sigma), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, l-глутамина, заменимых аминокислот, и антибиотики (100 Ед / мл пенициллина, 100 Ед / мл стрептомицина и 5 × 10 ^–3 мг / мл плазмоцина).Все клеточные линии поддерживали при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ . Аутентификация клеточных линий была подтверждена геномным профилированием коротких тандемных повторов. Метилметансульфонат был приобретен у Sigma. Темозоломид (Tocris Bioscience) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) с получением 100 мМ исходного раствора. Доксорубицин (Pharmacia & Upjohn) растворяли в стерильной воде с получением 1 мМ исходного раствора. Ингибитор протеасом MG132 (Calbiochem) и мышиный антагонист двойной минуты 2 (MDM2) нутлин-3 (Calbiochem) растворяли в ДМСО с получением 42 мМ исходных растворов.Все исходные растворы хранили в виде небольших аликвот в морозильнике при –20 ° C и дополнительно разбавляли в питательной среде перед добавлением в каждый эксперимент с культурой клеток.

Общая экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Контрольная общая РНК головного мозга человека была приобретена у Ambion. Синтез кДНК и количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) были выполнены, как описано ранее. ¹⁰ Использовали следующие пары праймеров: ALKBh3, прямой 5′-GCTGGGCTGACCTACACATT-3 ‘и обратный 5′-TGCCGGAAGACAAAGTCTCT-3′; MGMT, прямой 5’-CTGGAGCTGTCTGGTTGTGA-3 ‘и обратный 5′-CTGGTGAACGACTCTTGCTG-3′; 18S, прямой 5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 ‘и обратный 5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’.

Генерация стабильных клеточных линий GBM, сверхэкспрессирующих ALKBh3

КДНК

ALKBh3, экспрессирующая вектор pDEST26, была приобретена у imaGenes. Плазмидную ДНК выделяли с помощью системы очистки ДНК Wizard Plus SV Minipreps (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Мы трансфицировали 1 × 10 ⁵ клеток GBM ~ 2 мкг плазмидной ДНК в 6-луночном планшете с использованием реагента для трансфекции FuGENE HD (Roche Applied Science) в соответствии с инструкциями производителя. Селекцию трансфицированных клеток антибиотиками проводили с помощью генетицина 300 мкг / мл (Invitrogen).Устойчивые к генетицину колонии впоследствии подвергали скринингу на установившуюся сверхэкспрессию ALKBh3 с помощью вестерн-блоттинга.

Экстракция белков и вестерн-блоттинг

Клетки промывали фосфатно-солевым буфером, лизировали в буфере (pH 7,2), содержащем 20 мМ 3- (N-морфолино) пропансульфоновую кислоту, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ этиленгликольтетрауксусную кислоту, 30 мМ NaF, 0,5% Тритон-X. , 40 мМ β-глицерофосфат, 20 мМ Na-пирофосфат, 1 мМ Na-ортованадат, 3 мМ бензамидин, 5 мкМ пепстатин, 10 мкМ лейпептин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и неоднократно подвергались ультразвуковой обработке с использованием Sonics Vibra Cell (Cole-Parmer Instruments).Лизаты общего белка центрифугировали при 10 000 g в течение 15 мин и использовали полученный супернатант. Экстракты общего белка подвергали электрофорезу с использованием готовых гелей NuPage Bis-Tris 4–12% (Invitrogen). Остальную процедуру выполняли, как описано ранее. ¹⁰ Использовали следующие первичные антитела: мышиные моноклональные анти-ALKBh3 (A8228; Sigma), кроличьи поликлональные анти-β-актин (ab8227; Abcam), мышиные моноклональные анти-MDM2 (OP46; Calbiochem), мышиные моноклональные анти-p21 (556431; BD Pharmingen) и кроличий поликлональный анти-p53 модулятор апоптоза (PUMA) (№ 4976; Cell Signaling Technology).Вторичные антитела козьего антимышиного иммуноглобулина (Ig) G-пероксидазы хрена (HRP) (sc-2005) и козьего анти-кроличьего IgG-HRP (IM0831) были получены от Santa Cruz Biotechnology и Beckman Coulter, соответственно.

Анализы жизнеспособности и клоногенности клеток

Мы высевали 3 × 10 ³ клеток в 100 мкл ростовой среды в каждую лунку 96-луночного планшета. На следующий день питательную среду удаляли и заменяли новой средой, содержащей 500–2000 мкМ темозоломида, 100–400 мкМ метилметансульфоната или 0.5–3 мкМ доксорубицин. Контрольные клетки получали только носитель лекарственного средства. Через 96 часов 20 мкл CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (анализ MTS, Promega) добавляли в каждую лунку на 1 час перед тем, как оптическую плотность при 490 нм регистрировали на считывающем устройстве для 96-луночных планшетов. Оптическую плотность лунок, содержащих только питательную среду, вычитали для корректировки фоновой оптической плотности. Концентрацию каждого лекарственного средства анализировали в четырех повторностях, и каждый эксперимент повторяли не менее двух раз. Анализы клоногенной выживаемости проводили путем высева 300 клеток в каждую лунку в 6-луночные планшеты.Клетки обрабатывали 1500 мкМ темозоломида, 300 мкМ метилметансульфоната или 2 мкМ доксорубицина в течение 24 часов, после чего среду для роста заменяли свежей средой, не содержащей лекарственного средства, и оставляли клетки для пролиферации в течение 10 дней. Затем колонии фиксировали 6% глутаровым альдегидом, окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым и подсчитывали. Были включены только колонии, насчитывающие более 50 клеток.

Проточные цитометрические анализы

Синтез ДНК

как показатель клеточной пролиферации определяли путем оценки включения аналога тимидина 5-этинил-2′-дезоксиуридина (Edu) в геномную ДНК с использованием набора для проточной цитометрии Click-IT Edu Alexa Fluor 647 (Invitrogen).Клетки метили 10 мкМ Edu в течение 1 часа, фиксировали в 4% параформальдегиде и окрашивали в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, клетки окрашивали йодидом пропидия для определения содержания ДНК и распределения фаз клеточного цикла. Клетки анализировали на проточном цитометре C6 (Accuri Cytometers), а полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo версии 7.6.3 (Tree Star).

Трансфекция малой интерферирующей РНК, направленная на ALKBh3

Клетки высевали до 50-60% конфлюэнтности в 6-луночный планшет.Трансфекцию малой интерферирующей (si) РНК проводили на следующий день в бессывороточных условиях с использованием реагента олигофектамина (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя с небольшими изменениями. Клетки собирали через 72 часа после трансфекции, и нокдаун ALKBh3 подтверждали вестерн-блоттингом. Использовали три различные последовательности миРНК (Ambion) против ALKBh3. Отрицательный контроль siRNA был включен во все эксперименты по трансфекции. Все миРНК использовали в конечной концентрации 20 нМ.Последовательности были: siRNA # 1, смысловой 5′-GAAUCUGACUUUUCGUAAAtt-3 ‘и антисмысловой 5′-UUUACGAAAAGUCAGAUUCac-3′; миРНК № 2, смысловой 5’-GUCUUCCCGUGAGAAAGAAtt-3 ‘и антисмысловой 5′-UUCUUUCUCACGGGAAGACtg-3′; siRNA # 3, смысловой 5’-GCACCGAGAUGAUGAAAGAtt-3 ‘и антисмысловой 5′-UCUUUCAUCAUCGGUGCtc-3’.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 3 независимых экспериментов. Статистический анализ проводился с использованием двустороннего критерия Стьюдента t , предполагая равные дисперсии. P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

ALKBh3 в изобилии экспрессируется в установленных клеточных линиях GBM и GBM человека

ALKBh3 повсеместно экспрессируется в широком диапазоне нормальных тканей человека, с пиковыми уровнями в яичках и поджелудочной железе. ¹¹ Однако, в какой степени ALKBh3 экспрессируется в раковых клетках человека в целом, в настоящее время в значительной степени неясно. Чтобы определить, экспрессируют ли клетки GBM ALKBh3, мы первоначально проверили панель из 11 установленных линий клеток GBM с помощью qRT-PCR.Как показано на фиг. 1A, помимо клеточной линии D37, в большом количестве экспрессировался ALKBh3 с уровнями экспрессии мРНК в 2–4 раза выше по сравнению с NHB. Впоследствии мы проанализировали уровни экспрессии мРНК ALKBh3 в независимом недавно опубликованном наборе данных по экспрессии генов, состоящем из 4 образцов NHB и 73 недавно диагностированных GBM. ¹² Интересно, что экспрессия ALKBh3 была значительно повышена в GBM человека примерно в 2 раза по сравнению с NHB (рис. 1B; P = 0,001). Таким образом, наши результаты идентифицируют повышенную экспрессию ALKBh3 как новую особенность установленных клеточных линий GBM и GBM человека.

Рис. 1.

Экспрессия ALKBh3 в клетках GBM и GBM человека. (A) Экспрессия мРНК ALKBh3 в панели из 11 линий клеток GBM с отпечатками ДНК по сравнению с NHB, определенная с помощью qRT-PCR. (B) Экспрессия гена ALKBh3 (зонд Affymetrix 225625_at) в 4 образцах NHB и в 73 недавно диагностированных GBM, полученных из ранее опубликованного набора данных. ¹² Рецидивирующая ГБМ была исключена из анализа. ** P <.01. (C) Корреляция между уровнями экспрессии мРНК ALKBh3 и чувствительностью к темозоломиду в MGMT-дефицитных (U87, A172 и D37) и MGMT-опытных (GaMg, HF66 и T98) клеточных линиях GBM.* P <.05, ** P <.01. (D) Уровни индукции ALKBh3 в клеточных линиях GBM с отличной базовой экспрессией ALKBh3 и статусом MGMT были количественно определены с помощью qRT-PCR после 24 часов воздействия темозоломида (TMZ) с дозировкой соответствующей полумаксимальной ингибирующей концентрации для каждой клеточной линии (IC ₅₀ ). . Увеличение мРНК ALKBh3 в клетках, получавших темозоломид, рассчитывали относительно соответствующих контрольных клеток, обработанных только носителем лекарственного средства (ДМСО). ** P <.01.

Рис. 1.

Экспрессия ALKBh3 в клетках GBM и GBM человека. (A) Экспрессия мРНК ALKBh3 в панели из 11 линий клеток GBM с отпечатками ДНК по сравнению с NHB, определенная с помощью qRT-PCR. (B) Экспрессия гена ALKBh3 (зонд Affymetrix 225625_at) в 4 образцах NHB и в 73 недавно диагностированных GBM, полученных из ранее опубликованного набора данных. ¹² Рецидивирующая ГБМ была исключена из анализа. ** P <.01. (C) Корреляция между уровнями экспрессии мРНК ALKBh3 и чувствительностью к темозоломиду в MGMT-дефицитных (U87, A172 и D37) и MGMT-опытных (GaMg, HF66 и T98) клеточных линиях GBM.* P <.05, ** P <.01. (D) Уровни индукции ALKBh3 в клеточных линиях GBM с отличной базовой экспрессией ALKBh3 и статусом MGMT были количественно определены с помощью qRT-PCR после 24 часов воздействия темозоломида (TMZ) с дозировкой соответствующей полумаксимальной ингибирующей концентрации для каждой клеточной линии (IC ₅₀ ). . Увеличение мРНК ALKBh3 в клетках, получавших темозоломид, рассчитывали относительно соответствующих контрольных клеток, обработанных только носителем лекарственного средства (ДМСО). ** P <.01.

Поскольку экспрессия мРНК ALKBh3 охватывала континуум от высокого к низкому в нашей панели клеточных линий GBM, мы затем исследовали, существует ли какая-либо корреляция между уровнями экспрессии ALKBh3 и чувствительностью к темозоломиду. Мы выбрали 3 клеточные линии U87, A172 и D37, чтобы представить высокий, средний и низкий уровни экспрессии мРНК ALKBh3 соответственно. Ни одна из этих клеточных линий не экспрессировала MGMT, как определено с помощью qRT-PCR (данные не показаны). Интересно, что мы наблюдали обратную зависимость между уровнями экспрессии ALKBh3 и чувствительностью к темозоломиду в этих клеточных линиях (рис.1С). Напротив, не было корреляции между уровнями экспрессии мРНК ALKBh3 и чувствительностью к темозоломиду в опытных MGMT клеточных линиях GaMg, HF66 и T98. Взятые вместе, эти данные предполагают, что уровни экспрессии мРНК ALKBh3 обратно коррелируют с чувствительностью к темозоломиду в MGMT-дефицитных клеточных линиях GBM. Поскольку воздействие на клетки химиотерапевтических препаратов может спровоцировать ответ на повреждение ДНК, мы обработали 6 различных клеточных линий GBM на рис. 1C их соответствующей полумаксимальной ингибирующей концентрацией (IC ₅₀ ) дозой темозоломида в течение 24 часов и количественно определенными уровнями индукции ALKBh3. методом qRT-PCR.Как показано на фиг. 1D, уровни ALKBh3 увеличились примерно в 2 раза во всех клеточных линиях после 24 часов воздействия темозоломида. Однако мы не наблюдали какой-либо значительной связи между индуцированными уровнями ALKBh3 и соответствующими исходными уровнями экспрессии, но экспрессия ALKBh3 была наиболее индуцирована в клеточных линиях HF66 и T98, обладающих навыками MGMT. Напротив, уровни экспрессии MGMT существенно не изменились в клетках GaMg, HF66 или T98 во время воздействия темозоломида, как определено с помощью qRT-PCR (данные не показаны).

Сверхэкспрессия ALKBh3 способствует устойчивости к темозоломиду в клетках GBM

Чтобы исследовать потенциальное функциональное значение активации ALKBh3 в клетках GBM, мы стабильно сверхэкспрессировали ALKBh3 в клеточных линиях U87 и U251 GBM. Два независимых клона, сверхэкспрессирующих ALKBh3, были отобраны из каждой клеточной линии для последующих экспериментов (фиг. 2A). Поскольку цитотоксичность химиотерапевтических препаратов сильно зависит от скорости клеточной пролиферации, мы сначала исследовали, влияет ли избыточная экспрессия ALKBh3 на пролиферацию клеток, измеряя включение Edu в клоны, сверхэкспрессирующие ALKBh3, и в их соответствующих генетически устойчивых контролях.Как показано на дополнительных фиг. 1A и B, не наблюдалось значительных различий в размере популяции S-фазы между клетками, сверхэкспрессирующими ALKBh3, и соответствующими им контрольными клетками в любой клеточной линии, что указывает на то, что повышенные уровни ALKBh3 не изменяют пролиферацию клеток. Затем мы обрабатывали клеточные линии увеличивающимися дозами темозоломида, метилметансульфоната или доксорубицина в течение 96 часов перед оценкой индуцированной лекарством цитотоксичности с использованием анализа пролиферации клеток MTS. Клетки U87 и U251, сверхэкспрессирующие ALKBh3, показали значительно повышенную устойчивость к химиотерапии как темозоломидом, так и метилметансульфонатом по сравнению с соответствующими контрольными клетками (рис.2B и C). Напротив, сверхэкспрессия ALKBh3 не увеличивала клеточную устойчивость к лечению доксорубицином (рис. 2B и C), предполагая, что повышенная активность ALKBh3 опосредует устойчивость к лекарственным средствам преимущественно к метилирующим агентам. Чтобы дополнительно подтвердить эти результаты, мы провели клоногенные анализы выживаемости с использованием клеток U251, сверхэкспрессирующих ALKBh3, и соответствующих им контрольных клеток, устойчивых к геницину. После обработки темозоломидом или метилметансульфонатом клетки с избыточной экспрессией ALKBh3 демонстрировали значительно более высокие уровни клоногенной выживаемости по сравнению с контрольными клетками, подтверждая, что повышенная экспрессия ALKBh3 защищает от цитотоксичности, вызванной метилирующим агентом (рис.2D). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что избыточная экспрессия ALKBh3 не изменяет пролиферацию клеток, но увеличивает устойчивость к темозоломиду и метилметансульфонату в клетках GBM.

Рис. 2.

Сверхэкспрессия ALKBh3 увеличивает устойчивость к метилирующим агентам. (A) Клоны, стабильно сверхэкспрессирующие ALKBh3, были получены путем трансфекции клеток U87 и U251 плазмидой, меченной His, кодирующей ALKBh3. Верхняя полоса в вестерн-блоте представляет плазмиду, меченную His, тогда как нижняя полоса представляет экспрессию эндогенного ALKBh3.(B) U87 и (C) U251 ALKBh3-сверхэкспрессирующие клоны и их соответствующие контроли обрабатывали темозоломидом (TMZ), метилметансульфонатом (MMS) или доксорубицином (DOX) в течение 96 часов до определения цитотоксичности, вызванной лекарством, с использованием анализа MTS. Жизнеспособность клеток (%) рассчитывалась относительно соответствующих контрольных клеток, получавших только носитель лекарственного средства. Показанные результаты были получены с использованием клона №1 U87 и клона №1 U251. Столь же значимые данные были получены с использованием клона № 2 U87 и клона № 2 U251 (данные не показаны).* P <.05, ** P <.01. (E) Анализ образования колоний с использованием клеток, сверхэкспрессирующих U251 ALKBh3, и их соответствующих контролей. * P <.05, ** P <.01.

Рис. 2.

Сверхэкспрессия ALKBh3 увеличивает устойчивость к метилирующим агентам. (A) Клоны, стабильно сверхэкспрессирующие ALKBh3, были получены путем трансфекции клеток U87 и U251 плазмидой, меченной His, кодирующей ALKBh3. Верхняя полоса в вестерн-блоте представляет плазмиду, меченную His, тогда как нижняя полоса представляет экспрессию эндогенного ALKBh3.(B) U87 и (C) U251 ALKBh3-сверхэкспрессирующие клоны и их соответствующие контроли обрабатывали темозоломидом (TMZ), метилметансульфонатом (MMS) или доксорубицином (DOX) в течение 96 часов до определения цитотоксичности, вызванной лекарством, с использованием анализа MTS. Жизнеспособность клеток (%) рассчитывалась относительно соответствующих контрольных клеток, получавших только носитель лекарственного средства. Показанные результаты были получены с использованием клона №1 U87 и клона №1 U251. Столь же значимые данные были получены с использованием клона № 2 U87 и клона № 2 U251 (данные не показаны).* P <.05, ** P <.01. (E) Анализ образования колоний с использованием клеток, сверхэкспрессирующих U251 ALKBh3, и их соответствующих контролей. * P <.05, ** P <.01.

Подавление активности ALKBh3 с помощью трансфекции SiRNA делает клетки GBM сенсибилизирующими к темозоломиду

Чтобы дополнительно продемонстрировать функциональную роль ALKBh3 в устойчивости к темозоломиду, мы затем подавили экспрессию ALKBh3 в человеческих клеточных линиях GBM GaMg (опытный MGMT) и U87 (дефицит MGMT).Экспрессия белка ALKBh3 была эффективно подавлена, когда эти клетки были трансфицированы миРНК, нацеленной на ALKBh3, в то время как миРНК, не направленная на нацеливание, не оказывала влияния на уровни экспрессии ALKBh3 (фиг. 3А). Напротив, siRNA-опосредованное подавление ALKBh3 не влияло на уровни экспрессии клеточного MGMT (дополнительный рис. 2). Клетки обрабатывали темозоломидом, метилметансульфонатом или доксорубицином в течение 72 часов после трансфекции миРНК, и жизнеспособность клеток определяли с использованием анализа пролиферации клеток MTS.Нокдаун ALKBh3 с использованием последовательности №1 или последовательности №3 значительно повысил чувствительность клеток GaMg и U87 к химиотерапии темозоломидом и метилметансульфонатом по сравнению с контрольными трансфектантами (фиг. 3B и C). Напротив, молчание ALKBh3 не влияет на клеточный ответ ни на доксорубицин (фиг. 3B и C), ни на неметилирующий ДНК-повреждающий агент цисплатин (данные не показаны), дополнительно подтверждая, что ALKBh3 является медиатором устойчивости к метилирующему агенту. Эти результаты предполагают, что экспрессия ALKBh3 может нарушать цитотоксичность, вызванную темозоломидом, и что подавление экспрессии ALKBh3 соответственно увеличивает чувствительность клеток к темозоломиду.

Рис. 3.

Подавление экспрессии ALKBh3 увеличивает восприимчивость клеток к метилирующим агентам. (A) Клетки GaMg и U87 трансфицировали 3 отдельными последовательностями миРНК, нацеленными на ALKBh3, и нокдаун ALKBh3 подтверждали вестерн-блоттингом через 72 часа после трансфекции. Отрицательный контроль siRNA был включен во все эксперименты. (B) GaMg и (C) клетки U87 трансфицировали последовательностью siRNA №1 или №3 или отрицательным контролем и обрабатывали темозоломидом (TMZ), метилметансульфонатом (MMS) или доксорубицином (DOX) в течение 72 часов до индуцированной лекарством цитотоксичности. оценивали с помощью теста MTS.Жизнеспособность клеток (%) рассчитывалась относительно соответствующих контрольных клеток, получавших только носитель лекарственного средства. * P <.05, ** P <.01.

Рис. 3.

Подавление экспрессии ALKBh3 увеличивает восприимчивость клеток к метилирующим агентам. (A) Клетки GaMg и U87 трансфицировали 3 отдельными последовательностями миРНК, нацеленными на ALKBh3, и нокдаун ALKBh3 подтверждали вестерн-блоттингом через 72 часа после трансфекции. Отрицательный контроль siRNA был включен во все эксперименты.(B) GaMg и (C) клетки U87 трансфицировали последовательностью siRNA №1 или №3 или отрицательным контролем и обрабатывали темозоломидом (TMZ), метилметансульфонатом (MMS) или доксорубицином (DOX) в течение 72 часов до индуцированной лекарством цитотоксичности. оценивали с помощью теста MTS. Жизнеспособность клеток (%) рассчитывалась относительно соответствующих контрольных клеток, получавших только носитель лекарственного средства. * P <.05, ** P <.01.

Негенотоксическая активация пути p53 подавляет уровни экспрессии ALKBh3

Супрессор опухолей p53 действует как специфичный для последовательности фактор транскрипции, который регулирует экспрессию широкого спектра генов (кодирующих как белки, так и микроРНК), участвующих в различных клеточных процессах, включая репарацию ДНК.Показав, что ALKBh3 может способствовать устойчивости к темозоломиду, мы впоследствии исследовали, будет ли активация пути p53 изменять уровни экспрессии ALKBh3 в клетках GBM. Клеточная линия CCF-STTG1 GBM несет в себе амплификацию гена MDM2 на хромосоме 12, что приводит к функциональной отмене пути p53. ¹³ Секвенирование гена TP53 в клетках CCF-STTG1 не выявило каких-либо мутаций (данные не показаны), что согласуется с мнением о том, что амплификация MDM2, и мутация p53 являются взаимоисключающими событиями. ¹⁴ Чтобы исследовать влияние активации p53 на клеточные уровни ALKBh3, мы обрабатывали клетки CCF-STTG1 увеличивающимися концентрациями селективного антагониста MDM2 нутлина-3 в течение 24 часов. Нутлин-3 эффективно разрушает взаимодействие p53 / MDM2, стабилизирует p53 и активирует путь p53 без необходимости в предшествующих сигнальных событиях, таких как повреждение ДНК. ¹⁵ В соответствии с активацией функционального пути p53, обработка нутлином-3 приводила к увеличению уровней белка p53 и его истинных мишеней MDM2, p21 и PUMA дозозависимым образом (рис.4А). Кроме того, нутлин-3 индуцировал заметную остановку клеточного цикла в фазах G1 и G2 / M, что согласуется с предыдущими наблюдениями (рис. 4B). ¹⁶ Интересно, что уровни ALKBh3 соответственно снижаются во время воздействия нутлина-3, указывая тем самым, что усиление передачи сигналов p53 может подавлять ALKBh3 (Fig. 4A and C). Затем клетки CCF-STTG1 обрабатывали нутлином-3 и ингибитором протеасом MG132, чтобы исследовать, является ли снижение уровней ALKBh3 следствием повышенной деградации белка. Однако, как показано на рис.Воздействие 4C, MG132 не привело к значительному восстановлению уровней белка ALKBh3 во время терапии нутлином-3. Чтобы увидеть, снижает ли активация p53 ALKBh3 на уровне транскрипции, мы количественно оценили мРНК ALKBh3 с помощью qRT-PCR после обработки нутлином-3 в клетках CCF-STTG1. Мы обнаружили, что уровни мРНК ALKBh3 все больше подавлялись с увеличением концентрации нутлина-3 (рис. 4D), указывая на то, что снижение уровней ALKBh3 было связано с подавлением транскрипции, а не с увеличением деградации белка.Для дальнейшего подтверждения этих результатов мы обрабатывали клетки U87 и U251 GBM, которые экспрессируют wt и мутантный p53, соответственно, нутлином-3 в течение 24 часов. В соответствии с нашими результатами в клеточной линии CCF-STTG1, обработка нутлином-3 увеличивала уровни белка p53 и его транскрипционных мишеней MDM2, p21 и PUMA в клетках U87, но не в клетках U251 (рис. 4E). Важно отметить, что уровни экспрессии ALKBh3 после воздействия нутлина-3 снижались исключительно в клетках U87 (Fig. 4E), указывая на то, что экспрессия wt-p53 является абсолютным требованием для опосредованной нутлином репрессии ALKBh3.Более того, уровни мРНК ALKBh3 были значительно снижены в клетках U87, но не в клетках U251 после терапии нутлином-3 (фиг. 4F). Взятые вместе, эти данные показывают, что негенотоксическая активация wt-p53 антагонистом MDM2 нутлином-3 репрессирует уровни транскрипции ALKBh3 в клетках GBM человека.

Рис. 4.

Негенотоксическая активация пути p53 нутлином-3 подавляет экспрессию ALKBh3. (A) Клетки CCF-STTG1 обрабатывали антагонистом MDM2 нутлином-3 (0-8 мкМ) в течение 24 часов перед сбором клеточных лизатов для вестерн-блоттинга.(B) Профили клеточного цикла клеток CCF-STTG1, обработанных либо носителем лекарственного средства (ДМСО), либо 8 мкМ нутлином-3 в течение 24 часов, определяли с помощью мечения Edu и проточной цитометрии. Клетки в каждой фазе рассчитывали из цитограмм потока и выражали как процент от общей популяции клеток. (C) Вестерн-блоттинг клеток CCF-STTG1, обработанных лекарственным носителем, 8 мкМ нутлином-3, 25 мкМ MG132 или обоими в течение 24 часов. (D) Уровни мРНК ALKBh3, определенные с помощью qRT-PCR в клетках CCF-STTG1, обработанных 0-8 мкМ нутлином-3 в течение 24 часов. (E) Клетки U87 и U251 обрабатывали носителем лекарственного средства или 8 мкМ нутлином-3 в течение 24 часов перед сбором клеточных лизатов для вестерн-блоттинга.(F) Уровни мРНК ALKBh3, определенные с помощью qRT-PCR в клетках U87 и U251, обработанных носителем лекарственного средства или 8 мкМ нутлином-3 в течение 24 часов.

Рис. 4.

Негенотоксическая активация пути p53 нутлином-3 подавляет экспрессию ALKBh3. (A) Клетки CCF-STTG1 обрабатывали антагонистом MDM2 нутлином-3 (0-8 мкМ) в течение 24 часов перед сбором клеточных лизатов для вестерн-блоттинга. (B) Профили клеточного цикла клеток CCF-STTG1, обработанных либо носителем лекарственного средства (ДМСО), либо 8 мкМ нутлином-3 в течение 24 часов, определяли с помощью мечения Edu и проточной цитометрии.Клетки в каждой фазе рассчитывали из цитограмм потока и выражали как процент от общей популяции клеток. (C) Вестерн-блоттинг клеток CCF-STTG1, обработанных лекарственным носителем, 8 мкМ нутлином-3, 25 мкМ MG132 или обоими в течение 24 часов. (D) Уровни мРНК ALKBh3, определенные с помощью qRT-PCR в клетках CCF-STTG1, обработанных 0-8 мкМ нутлином-3 в течение 24 часов. (E) Клетки U87 и U251 обрабатывали носителем лекарственного средства или 8 мкМ нутлином-3 в течение 24 часов перед сбором клеточных лизатов для вестерн-блоттинга. (F) Уровни мРНК ALKBh3, определенные с помощью qRT-PCR в клетках U87 и U251, обработанных носителем лекарственного средства или 8 мкМ нутлином-3 в течение 24 часов.

Обсуждение

Устойчивость к химиотерапии темозоломидом является серьезной терапевтической проблемой в клиническом ведении ГБМ. Эпигенетическое подавление гена MGMT в опухолевых клетках за счет гиперметилирования промотора в настоящее время считается наиболее надежным предиктором ответа на темозоломид у пациентов с недавно диагностированным ГБМ. Однако около половины всех пациентов с GBM имеют неметилированный промотор опухоли MGMT . ¹⁷ В результате эти пациенты демонстрируют меньшую выживаемость при добавлении сопутствующей и адъювантной химиотерапии темозоломидом к стандартной лучевой терапии. ¹⁸ Таким образом, существует потребность в идентификации дополнительных медиаторов устойчивости к темозоломиду в GBM человека и решить, могут ли эти механизмы служить новыми терапевтическими мишенями в сочетании с традиционными методами, такими как радио- и химиотерапия. Наши данные показывают, что белок репарации ДНК ALKBh3 высоко экспрессируется в клетках GBM и в GBM человека по сравнению с NHB, и что воздействие темозоломида может дополнительно повышать уровни транскрипции ALKBh3. Об аналогичных результатах было сообщено в небольшой группе опухолей головного мозга у детей, в которых экспрессия мРНК ALKBh3 была увеличена по сравнению с образцами NHB. ¹⁹ Напротив, ALKBh3 часто подавлялся в биоптатах из карцином желудка по сравнению с соседней неопухолевой слизистой оболочкой, предполагая, что потеря экспрессии ALKBh3 может вносить вклад в злокачественную трансформацию слизистой оболочки желудка, возможно, из-за нарушения функции репарации ДНК. ²⁰ Эти противоречивые наблюдения могут означать, что ALKBh3 по-разному регулируется в разных тканях и соответствующих им опухолях, но для решения этого необходимы дальнейшие углубленные исследования.

В этой работе мы идентифицировали белок репарации ДНК ALKBh3 как новый механизм устойчивости к темозоломиду в клетках GBM человека. Напротив, измененные уровни экспрессии ALKBh3 не влияли на клеточный ответ на неметилирующие агенты доксорубицин и цисплатин. Это указывает на то, что ALKBh3 действует как медиатор устойчивости к метилирующему агенту, что согласуется с его ферментативными свойствами как окислительной деметилазы. Ранее описанная кристаллическая структура комплекса ALKBh3 – двухцепочечная ДНК обеспечивает структурную основу для разработки низкомолекулярных ингибиторов репарации ДНК, опосредованной ALKBh3. ²¹ Наши результаты, показывающие роль ALKBh3 в устойчивости к темозоломиду, дают обоснование для будущей разработки ингибиторов ALKBh3 с целью повышения эффективности химиотерапии темозоломидом у пациентов с ГБМ. Чтобы выяснить, связана ли повышенная экспрессия ALKBh3 с плохим исходом при недавно диагностированном ГБМ, мы проанализировали 2 независимых недавно опубликованных набора данных по экспрессии генов, в которых 46 и 35 пациентов лечились лучевой терапией и темозоломидом, соответственно. ^12,22 Однако мы не смогли обнаружить какой-либо статистически значимой связи между экспрессией ALKBh3 на момент постановки диагноза и исходом ни в одной из двух когорт ( P =.26 и P = 0,18 соответственно). Это может быть связано с небольшим размером выборки или тем фактом, что экспрессия ALKBh3 во время постановки диагноза не обязательно отражает уровни экспрессии, достигнутые во время курса терапии, поскольку мы показали, что ALKBh3 индуцируется темозоломидом, тогда как активация wt-p53 может репрессировать транскрипцию ALKBh3.

В настоящее время идентифицировано 9 гомологов AlkB человека, и их биологические свойства, а также их потенциальная роль в развитии рака быстро начинают выясняться.Недавно сообщалось, что опосредованная лентивирусами сверхэкспрессия ALKBh3 в клеточных линиях рака желудка вызывает снижение пролиферации, усиление апоптоза и остановку клеточного цикла в фазе G1 из-за повышенных уровней p16 и p21. ²⁰ Более того, нокдаун ALKBh3 в сверхэкспрессирующих клетках ускоряет клеточную пролиферацию по сравнению с контрольными трансфектантами, указывая на то, что потеря экспрессии ALKBh3 способствует росту клеток рака желудка. Экспрессия ALKBh3 ранее была вовлечена в устойчивость к фотодинамической терапии (PDT) в клетках U87 GBM. ²³ SiRNA-опосредованный нокдаун ALKBh3, соответственно, увеличивает эффективность PDT, заставляя исследователей предполагать, что PDT может вызывать повреждения оснований ДНК, которые могут быть субстратами для ALKBh3-опосредованной репарации. Однако остается неясным, является ли это точным механизмом этих выводов. Среди других белков ALKBH, ALKBh4, который отличается от ALKBh3 своей клеточной локализацией, а также субстратной специфичностью, высоко экспрессируется в карциномах простаты, легких и прямой кишки. ^24–26 Кроме того, ALKBH8 участвует в прогрессировании уротелиальных карцином. ²⁷ Наши результаты, демонстрирующие роль ALKBh3 в устойчивости к темозоломиду в человеческих клетках GBM, позволяют глубже понять постоянно расширяющиеся знания о семействе белков ALKBH.

Опухолевый супрессор p53 представляет собой специфичный для последовательности фактор транскрипции, который при клеточном стрессе, таком как повреждение ДНК, активация онкогенов и гипоксия, трансактивирует широкий спектр генов, продукты которых участвуют в репарации ДНК, остановке клеточного цикла, клеточном старении и апоптозе. .Кроме того, p53 влияет на другие клеточные процессы, такие как клеточный метаболизм, развитие стволовых клеток ²⁸ , ²⁹ и регуляция микроРНК. ³⁰ В нормальных, нестрессированных клетках активность p53 строго подавляется онкобелком MDM2, который, в свою очередь, транскрипционно активируется самим p53, тем самым создавая петлю отрицательной обратной связи. Мы обнаружили, что подавление ALKBh3 после активации p53 происходит на уровне транскрипции, что указывает на то, что активный путь p53 может подавлять уровни транскрипции ALKBh3 в клетках GBM человека.Интересно, что известно, что p53 транскрипционно репрессирует, как через прямые, так и косвенные механизмы, большое количество генов, участвующих в различных клеточных процессах, таких как апоптоз, клеточный цикл и рост клеток, судьба и развитие клеток, репликация и репарация ДНК, а также метаболизм. среди прочего. ³¹ Повышенные уровни ALKBh3 после повреждения ДНК ранее коррелировали с повышенным связыванием p53 с промотором гена ALKBh3, что указывает на то, что p53 может стимулировать уровни транскрипции ALKBh3. ²³ В совокупности с нашими открытиями это может указывать на то, что p53 может регулировать транскрипцию ALKBh3 по-разному в зависимости от клеточного контекста, то есть, присутствует ли генотоксическое повреждение или нет. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить это, а также точный механизм, лежащий в основе p53-обеспечиваемой репрессии транскрипции ALKBh3. Поскольку в большинстве случаев GBM экспрессируется wt-p53, ¹⁴ вполне вероятно, что активация p53, опосредованная нутлином, в этих опухолях может повысить чувствительность к темозоломиду не только за счет увеличения транскрипции проапоптотических генов, таких как PUMA и bcl-2-ассоциированные X, но также за счет подавления белков, таких как ALKBh3, которые в противном случае способствовали бы устойчивости к темозоломиду.

В заключение мы показали, что ALKBh3 высоко экспрессируется в клетках GBM и в GBM человека. Более того, это исследование, насколько нам известно, первое, в котором белок репарации ДНК ALKBh3 участвует в устойчивости GBM к лекарствам. Таким образом, наши результаты обеспечивают обоснование антагонизма активности ALKBh3 — например, посредством низкомолекулярных ингибиторов — с целью повышения эффективности темозоломида в клетках GBM. В будущих исследованиях следует изучить более крупные наборы данных по экспрессии генов, чтобы определить, имеют ли уровни экспрессии ALKBh3 в GBM какое-либо клиническое прогностическое и / или прогностическое значение.Более того, следует изучить уровни экспрессии ALKBh3 в других устойчивых к темозоломиду раках, таких как злокачественные меланомы, и потенциальное терапевтическое значение p53-опосредованной репрессии hABh3.

Финансирование

Эта работа была поддержана Норвежским онкологическим обществом, Норвежским исследовательским советом, Innovest AS, Helse Vest, университетской больницей Хаукеланд и Бергенским фондом медицинских исследований.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Пьера Брэди за помощь в анализе экспрессии генов и Туве Йохансен и Марианну Энгер за техническую поддержку.

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

Список литературы

1« и др.

Лучевая терапия плюс сопутствующий и адъювантный темозоломид при глиобластоме

,

N Engl J Med

,

2005

, vol.

352

10

(стр.

987

—

996

) 2« и др.

Влияние лучевой терапии с сопутствующим и адъювантным темозоломидом по сравнению с одной лучевой терапией на выживаемость при глиобластоме в рандомизированном исследовании III фазы: 5-летний анализ исследования EORTC-NCIC

,

Lancet Oncol

,

2009

, vol.

10

5

(стр.

459

—

466

) 3,,,,.

ЯМР и молекулярное моделирование, исследование механизма активации противоопухолевого препарата темозоломид и его взаимодействия с ДНК

,

Biochemistry

,

1994

, vol.

33

31

(стр.

9045

—

9051

) 4,,,.

Химиолучевая терапия при злокачественной глиоме: стандарты лечения и направления на будущее

,

J Clin Oncol

,

2007

, vol.

25

26

(стр.

4127

—

4136

) 5,,.

Восстановление ДНК и раковые стволовые клетки — потенциальные партнеры в лекарственной устойчивости глиомы?

,

Лечение рака Ред.

,

2008

, т.

34

6

(стр.

558

—

567

) 6« и др.

Человеческие и бактериальные окислительные деметилазы восстанавливают повреждение алкилирования как в РНК, так и в ДНК

,

Nature

,

2003

, vol.

421

6925

(стр.

859

—

863

) 7« и др.

Идентификация нового, широко распространенного и функционально важного PCNA-связывающего мотива

,

J Cell Biol

,

2009

, vol.

186

5

(стр.

645

—

654

) 8,,,,.

Деметилазы AlkB разворачиваются по-разному

,

Восстановление ДНК (Amst)

,

2008

, т.

7

11

(стр.

1916

—

1923

) 9« и др.

Мыши с дефицитом репарации обнаруживают mABh3 как первичную окислительную деметилазу для репарации повреждений 1meA и 3meC в ДНК

,

EMBO J

,

2006

, vol.

25

10

(стр.

2189

—

2198

) 10« и др.

Сильно инфильтративные опухоли головного мозга демонстрируют пониженную химиочувствительность, связанную с фенотипом, подобным стволовым клеткам.

,

Neuropathol Appl Neurobiol

,

2009

, vol.

35

4

(стр.

380

—

393

) 11« и др.

Экспрессия и субклеточная локализация молекул семейства ABH человека

,

J Cell Mol Med

,

2007

, vol.

11

5

(стр.

1105

—

1116

) 12« и др.

Связанная со стволовыми клетками сигнатура «самообновления» и высокая экспрессия рецептора эпидермального фактора роста, связанная с устойчивостью к сопутствующей химиолучевой терапии при глиобластоме

,

J Clin Oncol

,

2008

, vol.

26

18

(стр.

3015

—

3024

) 13,,,,.

Анализ клеточных линий глиомы на амплификацию и сверхэкспрессию MDM2

,

Гены Хромосомы Рак

,

1994

, vol.

11

2

(стр.

91

—

96

) 14

Исследовательская сеть Атласа генома рака

Комплексная геномная характеристика определяет гены глиобластомы человека и основные пути пути

,

Nature

,

2008

, vol.

455

7216

(стр.

1061

—

1068

) 15« и др.

Активация пути р53 in vivo низкомолекулярными антагонистами MDM2

,

Science

,

2004

, vol.

303

5659

(стр.

844

—

848

) 16« и др.

Низкомолекулярные антагонисты MDM2 обнаруживают аберрантную передачу сигналов p53 при раке: значение для терапии

,

Proc Natl Acad Sci USA

,

2006

, vol.

103

6

(стр.

1888

—

1893

) 17« и др.

Метилирование промотора MGMT в злокачественных глиомах: готовы к персонализированной медицине?

,

Nat Rev Neurol

,

2010

, т.

6

1

(стр.

39

—

51

) 18,,, et al.

Подавление гена MGMT и польза от темозоломида при глиобластоме

,

N Engl J. Med

,

2005

, vol.

352

10

(стр.

997

—

1003

) 19« и др.

Опухоли головного мозга у детей: мутации двух диоксигеназ (hABh3 и hABh4), которые непосредственно восстанавливают повреждение алкилирования.

,

J Neurooncol

,

2009

, vol.

94

2

(стр.

195

—

201

) 20,,,,,.

Частое подавление hABh3 при раке желудка и его участие в росте раковых клеток

,

J Gastroenterol Hepatol

,

2011

, vol.

26

3

(стр.

577

—

584

) 21« и др.

Кристаллические структуры ферментов репарации ДНК / РНК AlkB и ABh3, связанных с дцДНК

,

Nature

,

2008

, vol.

452

7190

(стр.

961

—

965

) 22« и др.

Метилирование ДНК в глиобластоме: влияние на экспрессию генов и клинический исход

,

BMC Genomics.

,

2010

, т.

11

стр.

701

23,,,,,.

TP53 регулирует экспрессию гомолога 2 AlkB человека при устойчивости глиомы к фотофрин-опосредованной фотодинамической терапии

,

Br J Cancer

,

2010

, vol.

103

3

(стр.

362

—

369

) 24« и др.

Высокая экспрессия нового маркера PCA-1 в карциноме простаты человека

,

Clin Cancer Res

,

2005

, vol.

11

14

(стр.

5090

—

5097

) 25,,,,.

ALKBh4, гомолог AlkB человека, способствует выживанию клеток при немелкоклеточном раке легкого человека

,

Br J Cancer

,

2011

, vol.

104

4

(стр.

700

—

706

) 26,,.

Анализ дифференциально экспрессируемых генов в карциноме прямой кишки человека с использованием супрессивной субтрактивной гибридизации

,

Clin Exp Med

,

2011

, vol.

11

4

(стр.

219

—

226

) 27« и др.

Новый гомолог AlkB человека, ALKBH8, способствует прогрессированию рака мочевого пузыря человека

,

Cancer Res

,

2009

, vol.

69

7

(стр.

3157

—

3164

) 28,.

p53 и метаболизм

,

Nat Rev Cancer

,

2009

, vol.

9

10

(стр.

691

—

700

) 29« и др.

p53 индуцирует дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши путем подавления экспрессии Nanog

,

Nat Cell Biol

,

2005

, vol.

7

2

(стр.

165

—

171

) 30,,,.

MicroRNAs присоединяются к сети p53 — еще одна часть головоломки подавления опухолей

,

Nat Rev Cancer

,

2007

, vol.

7

11

(стр.

819

—

822

) 31,,,.

Элемент ответа p53 и репрессия транскрипции

,

Cell Cycle

,

2010

, vol.

9

5

(стр.

870

—

879

)

© Автор (ы) 2012. Опубликовано Oxford University Press от имени Общества нейроонкологии. Все права защищены. Для получения разрешений обращайтесь по электронной почте: [email protected].

Модуляция шаперонного теплового шока Cognate 70 эмбриональным (про) инсулином коррелирует с предотвращением апоптоза по JSTOR

Абстрактный

Появились новые идеи относительно функции инсулина во время развития, основанные на открытии того, что апоптоз во время нейруляции куриного эмбриона предотвращается препанкреатическим (про) инсулином. Характеризуя молекулы, участвующие в этом эффекте выживания инсулина, мы обнаружили инсулино-зависимую регуляцию молекулярного шаперона, родственного тепловому шоку 70 кДа (Hsc70), о клонировании которого у цыплят здесь сообщается.Этот шаперон, который обычно считается конститутивно экспрессируемым, обнаруживает регуляцию уровня своей мРНК и белка у нестрессированных эмбрионов во время раннего развития. Что еще более важно, было обнаружено, что уровни Hsc70 зависят от эндогенного (про) инсулина, как показано при использовании антисмысловых олигодезоксинуклеотидов против мРНК (про) инсулина в культивируемых нейрулирующих эмбрионах. Кроме того, в культивируемых эмбрионах апоптоз затронул в основном клетки с самым низким уровнем Hsc70, как показано одновременным иммуноокрашиванием Hsc70 и опосредованным терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой мечения конца UTP.Эти результаты свидетельствуют в пользу участия Hsc70, модулируемого эмбриональным (про) инсулином, в предотвращении апоптоза во время раннего развития и предполагают роль молекулярного шаперона в нормальном эмбриогенезе.

Информация о журнале

PNAS — это самый цитируемый в мире междисциплинарный научный сериал. Он публикует высокоэффективные исследовательские отчеты, комментарии, мнения, обзоры и т. Д. доклады коллоквиума и акции Академии. В соответствии с руководящими принципы, установленные Джорджем Эллери Хейлом в 1914 году, PNAS издает краткие первые объявления членов Академии и иностранных партнеров подробнее важный вклад в исследования и работу, которая, по мнению Участника, иметь особое значение.

Информация об издателе

Национальная академия наук (НАН) — это частная некоммерческая организация ведущих исследователей страны. НАН признает и продвигает выдающуюся науку путем избрания в члены; публикация в своем журнале PNAS; и его награды, программы и специальные мероприятия. Через Национальные академии наук, инженерии и медицины NAS предоставляет объективные, научно обоснованные советы по важнейшим вопросам, затрагивающим нацию.